عنوان کتاب:

حساسیت ‏گونه‌های ‏انتروکوکوس ‏فکالیس ‏و ‏فاسیوم ‏جدا ‏شده ‏از ‏طیور

نویسندگان:

دکتر ‏نگین ‏فرهادی ‏- ‏دکتر ‏سعید ‏رادمنش

فصـل سوم

مواد و روش‌ها

مطالعه حاضر در دو فصل زمستان سال 97 و بهار سال 98 (در هر فصل 50 نمونه ) مجموعاً 100 نمونه سوآب کلواکی از تعداد 100 طیور گوشتی با سنین مختلف در مرغداری­های استان کردستان و به‌صورت خوشه­ای تصادفی اخذ گردید. سوآب­ها در داخل میکروتیوپ­های استریل حاوی محلول سرم فیزیولوژی استریل گذاشته و فوراً به آزمایشگاه تحقیقاتی دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد سنندج منتقل گردید.

خلاصه و نیز همراه با شرح اقدامات صورت گرفته و به ترتیب توضیح داده شده‌اند:

استریل کردن سوآب‎های نمونه‌گیری

در مرحله‎ی ابتدایی به‌منظور حفظ استریلیته کار و اطمینان، اقدام به استریلیزاسیون سواب‎ها گردید. بدین ترتیب برای هر نمونه پرنده دو عدد سوآب چوبی سر پنبه‌ای داخل ورق آلومینیوم قرار داده شد سپس در داخل دستگاه اتوکلاو به مدت مشخص تا رسیدن به دمای استریلیزاسیون قرار داده شد.

استریل کردن میکروتیوب‎های نگهداری باکتری

در مرحله‎ی بعد میکروتیوب‎های 5/1 ml در داخل یک جار شیشه‌ای به مقدار کافی قرار داده شد و از آنجائی که ظروف شیشه‌ای به دلیل دمای بالای داخل اتوکلاو فشار بالای هوا در معرض انفجار قرار دارند، درب ظرف به‌طوری که مقدار کمی جریان هوا وجود داشته باشد بسته شد. سپس در داخل دستگاه اتوکلاو به مدت مشخص تا رسیدن به دمای استریلیزاسیون قرار داده شد. پس از اتمام استریلیزاسیون به هر میکروتیوب 5/1-1 سی‌سی آب مقطر استریل اضافه گردید.

اخذ نمونه‌های مدفوعی

به‌منظور اخذ نمونه به‌وسیله‌ی سوآب از پرندگان برای هر نمونه اقدام به آماده‌سازی سوآب استریل گردید. پرندگان در شرایط آرامش و با حفظ اخلاق و رعایت حقوق حیوانات روی میز قرار داده شدند و ابتدا یک سوآب مرطوب به داخل رکتوم پرنده برده شد و بعد از آغشته سازی به مدفوع و دیواره‎ی رکتوم پرنده بیرون آورده شد.

اضافه کردن سرم فیزیولوژی به میکروتیوب ها

برای آماده کردن نمونه‌ها جهت کشت باکتریایی در محیط‎های کشت انتخابی و به‌منظور حفظ زنده‌مانی باکتری‌های موجود در نمونه‌های اخذ شده، نمونه‌های مدفوعی می‎بایست داخل مایع استریل حل شوند. بدین منظور بعد از اخذ دو سوآپ کلواکی از هر پرنده، در داخل هر میکروتیوب یک سی‌سی آب مقطر استریل ریخته شد و سوآب‎ها در داخل آب مقطر استریل تکان داده شد تا نمونه‌ها داخل مایع حل شوند و قسمت مورد نیاز سوآپ شکسته و داخل میکروتیوب قرار داده شد.

حمل نمونه‌ها به آزمایشگاه در شرایط استاندارد

بعد از اخذ نمونه‌های توسط سوآپ‎های استریل و حل کردن محتوای نمونه‌ی اخذ شده به داخل سرم فیزیولوژی داخل میکروتیوب‎ها، نمونه‌ها و یخ به آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشکده دامپزشکی انتقال داده شدند.

آزمون‎های برای تشخیص باکتری انتروکوکوس

در آزمایشگاه نمونه­ها بر روی محیط بلاد آگار (BA ) حاوی 7-5 درصد خون دفیبرینه گوسفندی کشت و به مدت 48-24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. کلنی‎های با مورفولوژی انتروکوکوس از طریق رنگ‌آمیزی گرم، تست کاتالاز و کشت بر روی محیط بایل اسکولین آگار (BEA ) به روش فنوتیپی شناسایی گردید. به این ترتیب که باکتری­هایی دارای همولیز گاما و کاتالاز منفی پس از خالص‌سازی بر روی محیط BA, به محیط BEA منتقل شدند. به دلیل وجود املاح صفراوی و سدیم آزاید در محیط BEA از رشد سایر باکتری‌های گرم مثبت و منفی ممانعت می­گردد. انتروکوک­ها با تجزیه اسکولین به اسکولتین و گلوکز و ترکیب اسکولتین با آهن فریک تولید ترکیب آهن فنولی نموده و رنگ محیط را به قهوه­ای تیره تا سیاه تبدیل می­کنند (جانگ و همکاران، 2007)^[1]

کشت در محیط‎های رشد انتروکوکوس‌ها

برای تشخیص حضور باکتری‌های انتروکوکوس در نمونه‌های کلواکی اخذ شده، در ابتدا اقدام به تهیه محیط‎های کشت آگار خون‌دار و صفرا آسکولین و نمک 5/6 % گردید.

کشت روی محیط آگار خون‌دار

در گذشته انتروکوکوس‌ها را جزو استرپتوکوکوس‎ها تقسیم می‎کردند ولی آنالیز ژنومی انتروکوکوس‌ها نشان داد که آن‌ها جنس متفاوتی از استرپتوکوکوس‎ها می‌باشند. در این بخش الگوهای همولیتیک‌ گونه‌های استرپتوکوکوس به‌صورت کلی توضیح داده خواهد شد. بسیاری از استرپتوکوکوس‎ها، گلبول‎های قرمز خون را با درجات و الگوهای مختلف لیز می‎کنند.

بر همین اساس استرپتوکوکوس‎ها را بر اساس همولیز به سه دسته تقسیم می‎کنند:

آلفا: در این الگو لیز اریتروسیت‎ها اتفاق می‎افتد و هموگلوبین موجود در این سلول‎ها آزاد می‌شود، در نتیجه بر روی محیط کشت در اطراف کلنی‎های استرپتوکوکوس هاله یا پیگمان سبز رنگ ایجاد می‌شود.

بتا: در این الگوی همولیتیک، تخریب کامل اریتروسیت‎ها اتفاق می‎افتد به‌طوری که بر روی محیط کشت، اطراف کلنی‎های استرپتوکوکوس از حضور اریتروسیت‎ها خالی می‌شود و تمامی اریتروسیت‎ها لیز می‌شوند.

گاما: در این حالت هیچ‌گونه همولیزی صورت نمی‌گیرد. این نوع همولیز مخصوص گونه‌های انتروکوکوس می‎باشد.

نکته: آنزیم همولیزین موجود در باکتری‌های استرپتوکوکوس سبب تخریب اریتروسیت‎های موجود در محیط کشت می‌شود که خود به دو نوع O و S تقسیم می‌شود.

طرز تهیه آگار خون‌دار

برای بررسی الگوی همولیز باکتری‌های موجود در نمونه‌های اخذ شده، انجام تست همولیز بر روی محیط کشت خون آگار ضروری می‎نمود. بدین منظور ابتدا اقدام به تهیه‎ی محیط کشت خون آگار گردید. ابتدا مقدار ۳۲ گرم از پودر خون آگار (مرک-المان) به ۸۰۰ سی‌سی آب مقطر ۲ بار تقطیر شده اضافه شد. سپس محلول روی شعله قرار داده شد تا به رنگ شفاف در بیاید. در مرحله‎ی بعد درون اتوکلاو قرار داده شد تا در زمان مشخص به دمای استریلیزاسیون برسد. بعد از اتمام مرحله‎ی استریلیزاسیون به‌وسیله‌ی دستگاه اتوکلاو در محیط آزمایشگاه قرار داده شد تا دمای ظرف به ۵۷ درجه سانتی‌گراد برسد. در مرحله‎ی آخر مقدار ۶۰ سی‌سی خون دفیبرینه گوسفندی اضافه شد و درنهایت درون پلیت‎های 6 میلی‌لیتری ریخته شد تا بسته شود و آماده‎ی کشت و انجام آزمایشات تشخیصی گردد.

نحوه‎ی کشت بر روی محیط آگار خون‌دار

به‌منظور انجام کشت، تعداد 100 میکرولیتر از محتویات هر میکروتیوپ بر روی ناحیه یک محیط کشت بلاد آگار قرار داده شده و توسط آنس حلقوی استریل کشت ایزوله چهار مرحله‌ای انجام شد. سپس پلیت‎ها در داخل انکوباتور در دمای°C 37 به مدت ۴۸ ساعت قرار داده شد (به دلیل این که باکتری‌های انتروکوکوس‌ها دیر رشد هستند ۴۸ ساعت داخل انکوباتور قرار داده شد. بعد از گذشت ۴۸ ساعت از کشت، یک پرگنه شبه استرپتوکوکوس که به اشکال مختلفی از جمله پرگنه‎های سفید رنگ و یا فاقد رنگ و نیز پر گنه‎های طلایی‌رنگ بر روی محیط خون آگار دیده می‌شوند، توسط آنس استریل جدا شده و مجدداً بر روی بلاد آگار خالص‌سازی شد و درنهایت از کشت خالص‌شده روی لام قرار داده شد و به‌منظور تائید تشخیص وجود باکتری‌های انتروکوکوس اقدام به رنگ‌آمیزی گرم شد.

تائید حضور باکتری‌های انتروکوکوس بر روی لام

بعد از جداسازی پرگنه‎های شبه انتروکوکوس اقدام به رنگ‌آمیزی گرم شد. سپس برای مشاهده‎ی میکروسکوپیک، عدسی روی بزرگ‌نمایی ۱۰۰ تنظیم شد و کوکسی‎های گرم مثبت که مانند دانه‎های تسبیح کنار هم قرار می‎گیرند مشاهده شد.

انجام آزمایش کاتالاز

بعد از مشاهده‎ی باکتری‌های کوکسی گرم مثبت با زنجیره‎های کوتاه در زیر میکروسکوپ، به‌منظور پیشرفت به سمت تشخیص حضور باکتری‌های انتروکوکوس و تفریق باکتری‌های انتروکوکوس از استافیلوکوکوس، تست کاتالاز بر روی نمونه‌ها انجام شد برای تشخیص میکروارگانیسم‌هایی که قادر به تولید آنزیم کاتالاز هستند در روی لام مقداری هیدروژن پراکسید ریخته و باکتری به‌وسیله‌ی یک اپلیکاتور درون آن قرار گرفت ایجاد حباب‎های اکسیژن کلید تشخیص وجود آنزیم کاتالاز است. بدین منظور ۲ قطره از پراکسید هیدروژن بر روی لام حاوی باکتری چکانده شد و هیچ‌گونه حباب یا واکنش مثبتی مشاهده نشد که نشان از کاتالاز منفی بودن باکتری‌های مورد آزمایش بود.

تهیه و کشت بر روی محیط صفرا اسکولین

این محیط دارای بایل (نمک صفراوی) و اسکولین نوعی ترکیب گلیکوزیدی که از پوست درخت شاه‌بلوط به دست می‎آید) می‎باشد پس باکتری‌هایی که قادر به تحمل نمک هستند در این محیط رشد می‎کنند. درصورتی‌که باکتری قادر به هیدرولیز اسکولین باشد گلوکز و اسكولتين یک مولکول الکلی) آزاد می‌شود سپس اسکولتین با یون فریک موجود در محیط ایجاد کمپلکس سیاه رنگ می‎دهد که دلیل تشکیل رنگ سیاه در محیط همین واکنش می‎باشد. برای تهیه‎ی محیط صفرا اسکولین به‌منظور کشت باکتریایی، مقدار 5/64 گرم پودر صفرا اسکولین آگار (مرك، المان) در یک لیتر آب مقطر حرارت داده حل شد و سپس جوشانده شد تا شفاف شود. سپس ظرف حاوی مایع داخل اتوکلاو به مدت 15 دقیقه و رسیدن به دمای 121 درجه استریلیزاسیون قرار داده شد. بعد از آماده‌سازی محیط کشت صفرا اسکولین، برای کشت باکتریایی بر روی این محیط به‌صورت زیر اقدام شد:

با آنس استریل یک پرگنه از روی محیط خون آگار برداشته شد و روی محیط صفرا اسکولین به‌صورت خطی کشت شد. سپس پلیت‎ها به مدت ۲۴ ساعت در دمای C°۳۷ قرار داده شد. با توجه به مباحث مطرح شده در بحث تشخیص و تفریق آزمایشگاهی گونه‌های انتروکوکوس و کشت باکتریایی بر روی محیط خون آگار و مشاهده همولیز به بررسی بیشتر وجود باکتری‌های انتروکوکوس، اقدام شد.

بررسی الگوی همولیز باکتری‌های مورد مطالعه

برای بررسی همولیز باکتری‌های مورد مطالعه، با آنس استریل یک پرگنه از باکتری‌های کشت داده شده درون محیط خون آگار برداشته شد و به یک پلیت جدید منتقل شد و کشت خطی داده شد و درون انکوباتور قرار داده شد تا باکتری‌های جدید رشد کنند.

تهیه محیط نمک

5/6 درصد محیط BHI که حاوی نمک سدیم کلراید می‎باشد به‌منظور تفریق باکتری‌های انتروکوکی از باکتری‌های غیر انتروکوکی (دیگر استرپتوکوکوس‎های گروه D لانسفیلد) استفاده می‌شود. محیط رشد BHI یک محیط بسیار غنی از مواد مغذی می‎باشد که جهت رشد بسیاری از میکروارگانیسم‌ها می‎توان از آن استفاده نمود. این محیط همچنین حاوی آگار می‎باشد که جهت رشد باکتری‌های سریع رشد و دیر رشد مؤثر می‎باشد. محیط BHI به‌وسیله‌ی جوشاندن قلب یا مغز گاو تولید می‌شود. برای تهیه‎ی محیط نمک ابتدا مقدار ۴ گرم از پودر BHI(مرک، المان) با ۱۰۰ سی‌سی آب مقطر استریل مخلوط شد و هم زده شد. سپس به این محلول 5/6 گرم نمک طعم خالص اضافه شد.

سپس در لوله‎های آزمایش استریل به میزان ۵ سی‌سی از این محلول اضافه شد سپس با آنس استریل یک پرگنه از روی محیط کشت خون آگاردار برداشته شد و به لوله حاوی ۵ سی‌سی محیط نمک 5/6 ٪ تلقیح و به مدت ۲۴ ساعت در دمای °C 38 قرار داده شد. کدر شدن محیط نشانه رشد باکتری و مثبت بودن تست می‎باشد.

نگه‌داری باکتری

برای تهیه‎ی این محیط ابتدا مقدار ۲ گرم از پودر BHI (مرک، المان) با ۵۰ سی‌سی آب مقطر استریل درون فالکون مخلوط شد و هم زده شد. سپس مقدار ۱۵ سی‌سی از آن برداشته شد و به‌جای آن ۱۵ سی‌سی گلیسرول اضافه شد و در داخل اتوکلاو قرار داده شد سپس یک سی‌سی در میکروتیوپ‎های مخصوص جهت نگهداری در فریزر ۲۰-، ریخته شد سپس از باکتری مورد نظر که به‌صورت خالص تهیه شده بود برداشته و درون محیط کشت مایع حاوی گلیسرول و BHI تلقيح شد. در واقع این‌طور می‎توان گزارش داد که چه تعداد از نمونه‌های کلواکی اخذ شده از پرندگان حاوی باکتری‌های انتروکوکوس می‌باشند. بعد از نتیجه‎ی به دست آمده از کشت باکتری‎ها بر روی محیط نمک 5/6٪ و تائید حضور باکتری‌های انتروکوکوس در نمونه‌ها، بررسی الگوی حساسیت و مقامت آنتی‌بیوتیکی و انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز صورت گرفت.

آنتی‌بیوگرام

تست آنتی‌بیوگرام به روش آگار دیسک دیفیوژن و بر اساس تفسیر CLSI بر روی جدایه‌ها انجام گرفت.

دیسک‎های آنتی‌بیوتیکی مورد استفاده شامل: ونکومایسین (30mg)، پنی‌سیلین (10IU)، سفالکسین (30mg)، فلورفنیکل (30mg)، اکسی تتراسایکلین (30mg)، جنتامایسین (10mg)، سفتریاکسون (30mg) و سفازولین (30mg) می‌باشند.

تهیه محیط مولر هینتون آگار

محیط کشت مولر هینتون آگار مناسب‌ترین محیط جهت انجام تست حساسیت گونه‌های باکتریایی به آنتی‌بیوتیک‌های مرسوم می‎باشد چرا که میزان عوامل مهار کننده سولفانامیدها و تری متوپریم و تتراسایکلین در آن کم بوده و همچنین مقدار کاتیون‎های کلسیم و منیزیم موجود در آن تنظیم شده می‎باشد.

در این مطالعه به‌منظور تهیه‎ی محیط کشت مولر هینتون آگار ابتدا مقدار ۴۰ گرم از پودر مولر هینتون آگار (مرک، المان) در داخل ۱ لیتر آب مقطر استریل داخل بشر حل شد و سپس روی حرارت قرار داده شد تا در اثر گرما به حالت شفاف دربیاید. بعد از شفاف شدن محلول، بشر در داخل اتوکلاو قرار داده شد تا با رسیدن به دمای استریلیزاسیون آماده‎ی استفاده جهت انجام تست حساسیت آنتی‌بیوتیکی گردد.

بعد از انجام اتوکلاو محتوای محلول آماده شده به داخل پلیت‎های۱۰ سانتی‌متری ریخته شد تا بعد از سرد شدن و تعادل دمایی آماده‎ی استفاده گردند.

برای تلقیح باکتری انتروکوکوس مورد مطالعه جهت رشد و انجام تست حساسیت آنتی‌بیوتیکی درون محیط مولر هینتون آگار می‎بایست کدورت محیط مایع باکتری به حد استاندار نیم مک فارلند رسیده باشد، بدین منظور ابتدا اقدام به تهیه‎ی محلول استاندار نیم مک فارلند گردید.

روش تهیه محلول استاندارد نیم مک فارلند

کدورت نیم مک فارلند کدورتی در تست آنتی‌بیوگرام است که میزان کدر بودن نمونه خود را با آن مقایسه می‎کنیم. این محیط حاوی 10⁸ × 1.5 باکتری است. نحوه تهیه این محیط در آزمایشگاه به شرح زیر است: سوسپانسیونی با جذب نوری 13-0.08 در طول موج 625 نانومتر تهیه گردید.

[1] Jung