کتاب اثرات ‏ضد ‏میکروبی ‏اکتینومایسز ‏ها ‏بر ‏سویه ‏های ‏سودوموناس ‏ائروژینوزای ‏عفونت ‏های ‏سوختگی

فهرست
عنوان صفحه
فصـل اول (کلیات) 11
اکتینومیست ها 13
ویژگی های ساختمانی اکتینومیست ها 13
استفاده از اکتینومیست ها به عنوان عوامل ضد میکروبی 14
خصوصیات فیزیولوژی اکتینومایست ها 15
تفاوت ها و شباهت های اکتینومیست ها با باکتری ها و قارچ ها 15
ویژگی های استرپتومایسس ها 16
زیستگاه استرپتومایسس ها و اکتینومیست ها 17
اکوسیستم های دریایی 17
انواع استرپتومایسس ها در اکوسیستم های دریایی 18
جنس سودوموناس 19
سودوموناس آئروژینوزا(Pseudomonas aeruginosa ) 20
مکانیسم های مقاومت آنتی بیوتیکی در سودوموناس آئروژینوزا 21
مکانیسم های مقاومت به بتالاکتام ها 22
مکانیسم های مقاومت نسبت به آمینوگلوکوزیدها 27
AMEs 27
تغییر هدف 27
مکانیسم های غیر آنزیمی دخیل در ایجاد مقاومت نسبت به آمینوگلوکوزیدها 28
استراتژیهای لازم برای جلوگیری از مقاومت سودوموناس آئروژینوزا 29
ترکیب درمانی 29
محدودیت در استفاده 29
جلوگیری از عفونت 29
بیوفیلم 30
فصـل دوم (مروری بر تحقیقات گذشته ) 33
فصـل سوم ) مواد و روش کار ) 39
مواد و وسایل مورد نیاز 40
نمونه برداری 44
اندازه گیری pH رسوبات 44
اندازه گیری میزان شوری رسوب 44
غربالگری و جدا سازی اکتینومایستها از نمونه های رسوبات 45
جداسازی سودوموناس ائروژینوزا از نمونه های کلینیکی 45
تست کاتالاز 46
رشد در دمای 42 درجه سانتی گراد 46
تست O/F 46
تست ذوب ژلاتین 47
کشت در محیط TSI 47
تست تحرک 47
تست لیزین دکربوکسیلاز(LDC) 47
تست اورنیتین دکربوکسیلاز (ODC) 47
تست آرژنین دهیدرولاز (ADH) 48
تهیه سویه استانداردPseudomonas aeruginosa PTCC 1310 48
تهیه محلول نیم مک فارلند از سویه های کلینیکی جدا شده و استاندارد 48
تست آنتی بیوگرام 48
آماده کردن سوسپانسیون استرپتومایسس های جدا شده 49
روش انتشار در چاهک (well diffusion) 49
روش تهیه دیسک از استرپتومایسس های رشد کرده در محیط SCA 49
روش کشت غوطه ور 50
استخراج ترکیبات فعال زیستی 50
خالص سازی ترکیبات خام فعال 50
شناسایی متابولیت های بیواکتیو 50
شناسایی ایزوله فعال اکتینومیست 51
فصـل چهارم)نتایج) 55
ارتباط بین میزان شوری و pHنمونه های رسوب با(…) 56
جداسازی استرپتومایسس (Streptomyces) از نمونه های رسوبات 56
نتایج مربوط به جداسازی سودوموناس ائروژینوزا 59
نتایج حاصل از روش چاهک گذاری 60
نتایج حاصل از روش دیسک گذاری 63
نتایج تست ها 67
نتایج حاصل از روش GC/MS 68
فصـل پنجم )بحث و نتیجه گیری ) 73
منـابع و مآخـذ 79
منابع فارسی 79
منابع غیر فارسی 82

زیستگاه استرپتومایسس ها و اکتینومیست ها

این باکتری ها در همه جای طبیعت پراکنده اند و 50-10 درصد کل جمعیت میکروبی را در خاک تشکیل می دهند. در خاک های قلیایی، در داخل کمپوست ها، گل و لای رود خانه ها و بستر رودخانه ها زیاد بوده و تعدادشان تحت تاثیر عوامل فیزیکی، شیمیایی و زیستی می باشد. اغلب اکتینومیست ها ساپروفیت بوده و در نتیجه افزایش مواد آلی قابل تجزیه در خاک باعث افزایش تکثیر و فعالیت این باکتری ها می شود. جمعیتشان در چمنزارهایی که به مزارع تبدیل شده اند به علت کاهش محتوی مواد آلی کمتر شده است که می توان با افزایش ترکیبات آلی مانند کود احشام جمعیتشان را بهبود بخشید. تعداد اکتینومیست ها در هر گرم خاک 10⁵– 10⁸ عدد متغیر می باشد و هرچه میزان مواد آلی خاک بیشتر باشند جمعیت اکتینومیست ها بیشتر خواهد بود (38).خاک های قلیایی و خنثی برای رشد اکتینومیست ها مناسب می باشند (Yinduo   et al. 2007 وet al. 2002 Montesinos).

اکوسیستم های دریایی

بیش از ۷۵ درصد از کره ی زمین را آب های شیرین پوشانده است و گونه های متفاوتی از میکروب ها در خط ساحلی و مناطق صخره ای پرورش می یابند همچنین این گونه میکروب ها در سطح آب و عمق آب ها و در اکوسیستم های مخصوصی مثل مخزن هایی با دمای بالا، اکوسیستم مربوط به خط مرجانی استوایی و دهانه رودخانه ها، تالاب ها، گودال های آب شور و مرداب ها و درخت های شاه پسند موجود است. این آب های شور با محلول حل شده مشخص می شوند (Kim et al. 2012).

محیط دریاها نسبت به دیگر مکان های آبزی از ویژگی های خاص متفاوتی برخوردار است. ترکیبات محلولی شامل سدیم کلرید است که ۸۵ درصد از حلال موجود در آب دریاها را تشکیل می دهد و ۱۵ درصد باقی مانده را سولفات، پتاسیم،‌ کلسیم،‌ منیزیم و دیگر مقادیر تشکیل می دهند (Tatar et al. 2014).

میانگین شوری آب دریاها نزدیک به ppt ۳۵ است. که در اقیانوس از ppt ۳۷ تا ۳۳ متغیر است. بیشتر موجودات زنده در محیط دریایی نسبت به تغییرات قابل توجه در شوری آب دریا حساس هستند و نمی توانند خود را وفق دهند (Tan et al. 2006).

این خاصیت به میکروارگانیسم ها اجازه می دهد تا ترکیبات شیمیایی فعال متفاوت در برابر رقبای خاکی خود تولید کنند. این میکروارگانیسم ها خودشان را با رشد در محیط نمکی و با تولید محلولی سازگار مثل آمینواسیدها و یون های سیتوپلاسمی افزایش یافته، وفق می دهند (Tatar et al. 2014).

انواع استرپتومایسس ها در اکوسیستم های دریایی

استرپتومایسس های گونه  BD21-2ایزوله شده در نمونه ای از آب شور سطحی که از ساحل کایلا در هاوایی جمع آوری شده، نمکی عالی تولید می کند که فعالیت ضد میکروبی در برابر گرم مثبت ها و گرم منفی ها نشان داده است (Tatar et al. 2014).

نمونه های رسوبی دریا که از دریای بیسمارک در کشور پاپوآ گینه نو وجود ۱۰۲ اکتینومایسس همراه با دو گونه خانواده میکرومونوسپورآسه آ را به اثبات رسانده است (Tamura et al. 2011).

استرپتومایسس های گونه  B8005و B4842 در منطقه شور خلیج مکزیک برای فعالیت های ضد باکتری مشاهده شده اند.

گونه استرپتومایسس B8005 سه نوع آنتی بیوتیک تولید می کند:

تتراسنومایسین، رزیستومایسین و رزیستوفلاوین

80 قطعه از اکتینومایسس ها در نمونه های نمکی خارج از خلیج بنگال 72 عدد از این ایزوله ها در طیف خارجی فعالیت های ضد میکروبی نمایان شدند (( Olano et al. 2009.

بر طبق گزارشات در سال ۲۰۰۵ ایزوله ۸۸ اکتینومایسس از مناطق نزدیک خط ساحلی دریای آندامان در خلیج بنگال بیشتر فعالیت های ضد باکتری نوید بخش آن با استرپتومایسس، میکرومونوسپورآ و نوکاردیا نمایان شده است و گونه های استرپتومایسس BT606 و BT652 در مقابل سودوموناس ائروژینوزا و استافیلوکوکوس اورئوس فعال بوده اند. در مطالعه ای دیگر وجود ضد استرپتومایسس ها به عنوان نوعی که بقیه را در بر میگیرد در خط ساحلی دریای ادامنت گزارش شده است( Igarashi et al. 2005).

جنس سودوموناس

باکتری­های جنس سودوموناس، از خانواده سودوموناداسه که به شکل میله­ای راست یا کمی خمیده ، دارای تاژک قطبی، بدون اسپور و گرم منفی می­باشند. این باکتری­ها هوازی و از نظر منبع انرژی و کربن کیموارگانوتروف هستند. از نظر نیازهای غذایی گونه­های سودوموناس نیاز غذایی بسیار ساده ای دارند. در شرایط آزمایشگاهی در محیط های حاوی مقداری ماده آلی در pH خنثی به خوبی رشد می­کنند. از مهم ترین این محیط ها king´ B است. متابولیسم گونه­های سودوموناس تنفسی بوده و حالت تخمیری ندارند. این باکتری­ها قادرند از 150 ترکیب آلی به عنوان منبع کربن و انرژی استفاده نمایند. در سال­های گذشته گونه­های سودوموناس طبق طبقه­بندی محققین بر اساس مطالعات همسانی rRNA/DNA به پنج گروه تقسیم­بندی شده اند. از پنج گروه مذکور اخیراً فقط گروه 1 در جنس سودوموناس ابقا شده و بقیه در جنس­های جدید و یا موجود قبلی جای گرفته اند. گروه 1، به عنوان بزرگ ترین گروه انواع فلورسنت را در خود جای داده است. وجه تمایز سودوموناس­های فلورسنت از سایر سودوموناس­ها، تولید پیگمان­هایی است که در برابر نور طول موج کوتاه فرابنفش (254 نانومتر) به ویژه در شرایط کمبود آهن خاصیت فلورسانس دارند. به این پیگمان­ها با خاصیت فلورسنت و محلول در آب سیدروفور و اختصاصاً در مورد سودوموناس­ها پیووردین یا سودوباکتین گفته می­شود. از مهمترین گونه فلورسنت می­توان به سودوموناس آئروژینوزا اشاره کرد. (Amini et al.2012)

سودوموناس آئروژینوزا(Pseudomonas aeruginosa )

سودوموناس آئروژینوزا یک باکتری گرم منفی است که بیشتر در پیرامون ما یافت می­شود. این باکتری درآب، خاک و دیگر پیرامون­های نمناک یافت می­شود .سودوموناس آئروژینوزا یک بیماری زای فرصت طلب است. این باکتری از سیستم ایمنی افراد ناتوان بهره برده و در آن­ها عفونت ایجاد می­کند. سودوموناس آئروژینوزا سبب عفونت­های مجاری ادراری، سیستم تنفسی، التهاب و آماس پوست، عفونت­های بافت­های نرم ، باکتریمی (وجود باکتری در خون)، عفونت­های استخوان و مفاصل، عفونت­های معده و روده و عفونت­های سیستمیک گوناگون به ویژه در بیماران با سوختگی­های شدید، بیماران دچار سرطان و ایدز که سیستم ایمنی آن­ها سرکوب شده است، می­نماید. همچنین این باکتری ویژه افرادی است که دچار سیستیک فیبروزیس هستند و منبع مشترک عفونت شش­ها در این افراد است (Gilpin 2008).

اصولاً این باکتری یک پاتوژن بیمارستانی است. این ارگانیسم بیشتر از راه میوه­ها، گیاهان و سبزی­ها، عیادت کنندگان و بیمارانی که از دیگر بخش­ها منتقل می­شوند وارد پیرامون بیمارستان می­شود. گسترش و انتشار از بیماری به بیمار دیگر از طریق دست­های پرسنل بیمارستان، همچنین تماس مستقیم بیمار با منابع آلوده مانند خوردن آب و خوراک آلوده رخ می­دهد (Gilpin et al. 2008).

تشخیص عفونت ناشی از سودوموناس آئروژینوزا با جداسازی و تشخیص آزمایشگاهی رخ می­دهد. این باکتری به خوبی روی بیشتر پیرامون­های کشت آزمایشگاهی رشد می­کند و روی آگار خونی و آگار آبی ائوزین متیل تیونین جدا می­شود. شناسایی این باکتری بر پایه مورفولوژی گرم، ناتوانی در تخمیرلاکتوز (یک واکنش اکسیداز مثبت)، بوی میوه (با مزه انگور) و توانایی رشد در دمای 42 درجه سانتی گراد شناسایی می­شود. ویژگی فلوئورسانس آئروژینوزا نیز در تشخیص فوری کلنی­های سودوموناس آئروژینوزا مؤثر بوده و در تشخیص وجود آن در زخم­ها کمک می­کند. کلنی­های باکتری رودی محیط بلاد آگار درشت و موکوئید و بر روی محیط مکانیکی به صورت کلنی­های لاکتوز منفی با پیگمان سبز رنگ است (دشتی زاده ی ، 1393).

مکانیسم­های مقاومت آنتی بیوتیکی در سودوموناس آئروژینوزا

آنتی بیوتیک­هایی که برای درمان عفونت­های ایجاد شده توسط سودوموناس آئروژینوزا استفاده می­شوند شامل طیف وسیعی از بتالاکتام­ها از قبیل سفالوسپورین­ها (سفتازیدیم)، کارباپنم­ها (ایمی­پنم، مروپنم) و مونوباکتام­ها میباشد. سایر آنتی بیوتیک­های مؤثر در درمان عفونت­ها، شامل آمینوگلیکوزیدها (از قبیل جنتامایسین، توبرامایسین، آمیکاسین)، کیونولون­ها (از قبیل سیپروفلوکساسین) هستند که اخیراً از پلی میکسین­ها (از قبیل کلیستین و پلی­میکسین B) نیز استفاده می­گردد. در حال حاضر، میزان مقاومت این باکتری نسبت به آنتی­بیوتیک­های مختلف روز به روز در حال افزایش است. در ادامه به توضیح چندین مکانیسم اصلی مقاومت آنتی­بیوتیکی در سودوموناس آئروژینوزا پرداخته می شود (Gomez, 2016).

مقاومت ذاتی در واقع میزان عملکرد و قابلیت آنتی بیوتیک را در ارگانیسم­ها محدود می­کند. در باکتری های گرم منفی، مقاومت ذاتی میزان جذب آنتی­بیوتیک را محدود می­کند. نفوذ پذیری غشاء خارجی سودوموناس آئروژینوزا 100-12 برابر کمتر از سایر باکتری­های گرم منفی، از قبیل اشرشیاکلی است. این نفوذپذیری پایین در سودوموناس آئروژینوزا مشکل جدی را برای نفوذ آنتی بیوتیک ایجاد می کند و بنابراین تنها آنتی بیوتیک­های هیدروفیلیک از قبیل بتالاکتام­ها می توانند از غشاء عبور کنند. اگرچه نفوذ پذیری پایین غشاء خارجی این باکتری نقش مهمی را در ایجاد مقاومت­های دارویی ایفا می­کند اما تنها مکانیسم مقاومت ذاتی این باکتری نمی باشد بلکه سایر مکانیسم­های مقاومت ذاتی، از قبیل پمپ افلاکس و بتالاکتامازهای پری پلاسمیک منجر به مقاومت بالای این باکتری به بسیاری از آنتی بیوتیک­های مصرفی گردیده است. اگرچه مقاومت ذاتی به خودی خود بدون در معرض قرار گرفتن با آنتی بیوتیک در سلول وجود دارد اما مقاومت اکتسابی با در معرض قرار گرفتن با آنتی بیوتیک، جهش ژنی و به دست آوردن ژن­های مقاومتی از طریق عناصر ژنتیکی از قبیل پلاسمیدها ترانسپوزون­ها و اینتگرون­ها به دست می­آید. اگرچه مسئله به­دست آوردن ژن­های مقاومتی در سودوموناس آئروژینوزا به اندازه­ی سایر باکتری­ها رایج نیست اما اخیراً مشاهده شده است که پلاسمید کدکننده کارباپنمازها را کسب کرده­ است. این پلاسمید قابلیت هیدرولیز اکثر بتالاکتام­ها از قبیل کارباپنم­ها را دارد (Gomez, 2016).

یکی از مکانیسم­های رایج مقاومت اکتسابی نسبت به کارباپنم­ها جهش در ژن oprD است. oprD نوعی پورین اختصاصی در باکتری سودوموناس آئروژینوزا است و کانال ورودی قندها، پتیدهای کوچک و آمینو اسیدهای بازی و بعضی از داروها خصوصاً خانواده کارباپنم­ها به داخل باکتری می­باشد. این پورین اختصاصی بسیار شبیه پورین غیر اختصاصی OmpF در E. coli می باشد. فقدان ژن oprD یا کاهش بیان آن و یا جهش در این ژن منجر به کاهش ورود کارباپنم­ها به درون باکتری و در نهایت سبب مقاومت سودوموناس آئروژینوزا به کارباپنم­ها می­گردد. همچنین افزایش بیان ژن AmpC مقاومت سودوموناس آئروژینوزا را به بسیاری از بتالاکتام­ها از قبیل پنی­سیلین­ها، سفالوسپورین­ها و تا حد کمتری نسبت به کارباپنم­ها و مروپنم­ها افزایش می­دهد .مقاومت انطباقی توسط شرایط رشد، محرک­های محیطی، استرس­های فیزیکی و شیمیایی القا می­شود. از جمله مواردی که مقاومت انطباقی را القا می­کنند می­توان به آنتی بیوتیک­ها، PH، ناکافی بودن موادغذایی و … اشاره کرد (Gomez, 2016).

مکانیسم­های مقاومت به بتالاکتام­ها

سودوموناس آئروژینوزا به دلیل بیان دائم بتالاکتامازهای AmpC و پمپ­های افلاکس و همچنین نفوذپذیری پایین غشاء خارجی، نسبت به بسیاری از عوامل ضد میکروبی از قبیل بتالاکتام­ها، آمینوگلیکوزیدها و فلوئوروکینولون­ها مقاوم هستند (8).تولید آنزیم بتالاکتاماز یک مکانیسم اصلی برای مقاومت به آنتی بیوتیک بتالاکتام در سودوموناس آئروژینوزا است. ترانسفرازهای Penicilloyl – serine اتصال آمیدی حلقه­ی بتالاکتام را از بین می­برد. بنابراین محصولات تولید شده فاقد فعالیت­های ضد باکتریایی هستند

Strateva, Yordanov 2009)).

به طور طبیعی سودوموناس آئروژینوزا به کربوکسی پنی سیلین­ها و سفتازیدیم حساس است ولی نسبت به سفالوسپورین­های نسل سوم مقاومت نشان می­دهد. همانند بعضی از گونه­ها در خانواده­ی اینتروباکتریاسه (از قبیل اینتروباکتر، سراشیا، سیتروباکتر، یرسینیا) سودوموناس آئروژینوزا به کروموزوم کد کننده بتالاکتاماز AmPC که متعلق به رده ی مولکولی C است را تولید می کند. معمولاً این آنزیم در مقادیر کم تولید می شود و باعث مقاومت در آمینو­پنی­سیلین­ها و اکثر سفالوسپورین های نسل اول می­گردد. بتالاکتاماز AmpC توسط ژن ampC کد می شود.

چهار­کار پنی­سیلین هیدرولیز­کننده بتالاکتاماز در سودوموناس آئروژینوزا یافت شده که به شرح زیر است :

, CARB-4, CARB-3, PSE-4(CARB-1), PSE-1(CARB-2) این آنزیم­ها متعلق به کلاس مولکولی A و عملکرد گروه 2C است. PSE-1 و PSE-4 و CARB-3 بسیار به هم نزدیک هستند (آن­ها تنها دریک یا دو آمینواسید با هم­ تفاوت دارند) ، اما با CARB-4 تنها %3/86 شباهت دارند (Strateva, Yordanov 2009).

بر خلاف PSEsها، ESBLs ها و عملکرد گروه 2b´ منجر به افزایش مقاومت نه تنها به کربوکسی پنی سیلین­ها می­شود بلکه منجر به ایجاد مقاومت نسبت به طیف وسیعی از سفالوسپورین­ها (از قبیل سفتازیدیم، سفپیروم) و آزترونام میشود. به جز آنزیم­های TEM و SHV شناخته شده در خانواده­ی اینتروباکتریاسه در سودوموناس آئروژینوزا آنزیم های PER (اغلب در نمونه­های کلینیکی از ترکیه)، VEB (از جنوب شرق آسیا، فرانسه)،  GES/IBE  (فرانسه، یونان و جنوب افریقا) و BEL شناسایی شدند  ( Strateva , Yordanov 2009).

SHV-2a در سال 1995 در فرانسه شناسایی شد. این آنزیم به شدت سفالوسپورین­های نسل چهارم را هیدرولیز می­کند. همچنین SHV-5 و SHV-12 در سودوموناس آئروژینوزا در تایلند یافت شدند. SHV-5 مقاومت بالایی را نسبت به سفتازیدیم و مونوباکتام­ها ایجاد می­کند. آنزیم­های TEM جدا شده از سویه­های سودوموناس آئروژینوزا : TEM-2، TEM-4، TEM-21 و TEM-24 هستند. به نظر می­رسد که ژن­ها برای TEM و SHV نوع ESBL در سودوموناس آئروژینوزا از طریق انتقال ژن از اینتروباکتریاسه­ها هستند.PER-1 اولین ESBL شناسایی شده در سودوموناس آئروژینوزا بود که در سال 1991 در فرانسه از نمونه کشت ادرار جدا شد. اخیراً گسترش ژن blaPER-1 در بین نمونه های سودوموناس آئروژینوزا در ترکیه گزارش شده است. از سایر نقاط جغرافیایی می توان به ایتالیا، بلژیک و هلند اشاره کرد. آنزیم PER-1 توسط مهار کننده های بتالاکتاماز و ایمی­پنم ­ها مهار میشوند. یکی دیگر از انواع مولکولی ESBL ها، آنزیم های VEB هستند که اولین بار در فرانسه در سال 1991 جدا شد. بعدها Girlich و همکاران در سال 2002 شیوع بالاتری (93%) از ژن های bla VEB-like در نمونه های کلینیکی مقاوم به سفتازیدیم در بیمارستان تایلند را اعلام کردند. در طی این مطالعه، ژن جدید blaVEB-2 شناسایی شد. VEB-2 تنها یک آمینواسید در قسمت خارجی سایت فعال آنزیم VEB-1 تفاوت دارد.                          (Strateva, Yordanov 2009).

در قرن بیستم، خانواده ی جدیدی از ESBL ها توصیف شد(GES). GES-1 و GES-2 در فرانسه و برزیل و در جنوب افریقا یافت شدند. آنزیم GES-2 از جهش آنزیم GES-1 منشأ می­گیرد. همانند GES-1، GES-2 در موقعیت 68 و 238، سیتئین خود را از دست داده است که منجر به ایجاد پل دی سولفید می شود. GES-2 100 برابر فعالیت کاتالیکی آن به ایمی پنم نسبت به GES-1 بیشتر است. همچنین آنزیم­های GES-5 و GES-9 در سال 1999 در فرانسه شناسایی شدند. آنزیم GES-5 به میزان بیشتری پنی­سیلین­ها را هیدرولیز می کند. ژن bla GES-5 بر روی اینگرون کلاس یک قرار گرفته است و منجر به مقاومت به آمینوگلیکوزیدها می شود. همچنین آنزیم GES-9 تنها در یک آمینواسید با GES-1 متفاوت است. همچنین IBC-2 و GES-8 در سال 2001 در یونان در نمونه­های کلینیکی سودوموناس آئروژینوزا یافت شد. تولید این بتالاکتاماز مقاومت به سفتازیدیم و سایر اکسی­ایمونوسفالوسپورین ها را ایجاد می کند و توسط ایمی­پنم و تازوباکتام مهار می­شود. ژن­های کد کننده ESBLنقش مهمی را در ایجاد مقاومت­های آنتی­بیوتیکی ایفا می­کنند و انتخاب آنتی بیوتیک مناسب برای درمان عفونت­های ناشی از سودوموناس آئروژینوزا را مشکل می­کنند. پلاسمیدها و اینتگرون­ها فاکتورهای مهمی در ایجاد مقاومت هستند. در همین رابطه، موقعیت پلاسمیدها برای اکثر ژن­های کد­کننده آنزیم­های TEM و SHV در سودوموناس آئروژینوزا اثبات شده است. اگرچه ژن های کد­کننده بتالاکتامازهای کلاس B و کلاس  Dبر روی اینتگرون­های کلاس یک قرار دارندStrateva , Yordanov 2009)).

اکساسیلینازها (آنزیم های نوعOXA) متعلق به گروه مولکولی D و عملکرد گروه 2d است. آنزیم­های کلاسیک OXA (OXA-1, OXA-2, OXA-10) باعث مقاومت به کربوکسی­پنی­سیلین­ها می­شوند. همچنین مقاومت به تیکارسیلین و پیپراسیلین ناشی از تولید آنزیم های OXA-2 نسبت به زمانی که OXA-10 و OXA-1 تولید می­شوند بسیار کمتر است. اکساسیلینازهای هیدرولیز کننده سفتازیدیم اهمیت کلینیکی بسیار زیادی دارند. همچنین آن­ها سفوتاکسیم موکسالاکتام را نیز هیدرولیز می­کنند. به استثناء OXA-18 فعالیت این آنزیم­ها توسط مهارکننده­های بتالاکتاماز (تازوباکتام) مهار نمی­شود.OXA-11 ، OXA-14 و OXA-19 فعالیت سفتازیدیم را تحت تأثیر قرار می­دهند. در حالیکه OXA-17 سفوتاکسیم را تحت تأثیر قرار می­دهد. به طور کلی OXA-10 مقاومت پایینی را نسبت به سفالوسپورین های نسل چهارم نشان می­دهند. این در حالیست که نسبت به نسل سوم سفالوسپورین­ها بسیار مقاوم هستند. به جز OXA-15 و OXA-32 سایر اکسیلینازها از OXA-10منشأ گرفته اند. طیف وسیعی از اکسیلینازها توسط پلاسمیدها و اینتگرون­ها کد می­شوند و این افزایش شیوع ESBLهای گروه D در سودوموناس آئروژینوزا کمک می­کند. یکی دیگر از گروه های ESBL در سودوموناس آئروژینوزا آنزیم های هیدرولیز کننده کارباپنم­ها هستند که تحت عنوان MBLS به دلیل حضور 2n²⁺در هسته فعال آن­ها شناخته می­شوند. آن­ها متعلق به گروه مولکولی B هستند. تولید کارباپنم­ها باعث مقاومت به تمام بتالاکتام­ها از قبیل کارباپنم­ها، اپمی­پنم­ها و مروپنم می­شود و تنها آزترونام تحت تأثیر MBLSها قرار نمی­گیرد. فعالیت آنزیم­های هیدرولیزکننده کلاس B کارباپنم­ها توسط تازوباکتام مهار نمی­شود. انواع MBLS که در سودوموناس آئروژینوزا شناسایی شدند شامل IMP ،  VIM، SPM ، GIM می­باشند. اولین کارباپنماز در سودوموناس آئروژینوزا در سال 1992 IMP-1 بود. 11% از کل نمونه های مورد مطالعه­ی Senda در سال 1996 ژن bla IMP-1P حمل می کردند. این ژن بر روی یک پلاسمید 36kb قرار گرفته است. اخیراً IMP-1 از سویه­های سودوموناس آئروژینوزای مقاوم به کارباپنم در بیمارستان سنگاپور گزارش شده است .از سال 2000 تا 2001 سایر واریته­های IMP در سایر باکتری­های گرم منفی در جهان یافت شد. ژن bla IMP-7 در میان نمونه­های کلینیکی سودوموناس آئروژینوزا در کانادا و سنگاپور یافت شد و blaIMP-13 در ایتالیا، و در سال 2002، IMP-16 در سویه­های سودوموناس از برزیل و IMP-18 در امریکا یافت شده است                                ( Strateva , Yordanov 2009).

سودوموناس آئروژینوزا پتانسیل بیان 12 نوع تراوشی چند دارویی تحت عنوان MEX (Multiclruy efflux system) را دارد. از میان 5 پمپ به نام­های MexAB-oprM، MexCD-oprY، MexEF-oprN، MexXY-oprM، Mexdk-oprM از مهمترین عوامل مقاومت به آنتی بیوتیک­ها هستند. MexAB-oprM تنها پمپ تراوشی است که در سویه­های وحشی سودوموناس آئروژینوزا بیان می­شود و در مقاومت ذاتی این باکتری نقش دارد. سایر پمپ­ها بر اثر بروز جهش، بیان شده و در مقاومت اکتسابی این باکتری به برخی از آنتی­بیوتیک­ها نقش دارند. سیستم­های انتقالی Mex به خانواده RDN (Resistance Nodulation Dirision cell family) تعلق دارند. اعضای این خانواده با به کارگیری نیروی محرکه پروتونی غشا ترکیبات ضد میکروبی را از سلول خارج می­نمایند .ناقلین RNA از سه بخش اساسی تشکیل شده است. قسمت اول در غشای سیتوپلاسمی قرار دارد و آنتی پورتو پروتون- دارو می باشد. قسمت دوم در خش پری پلاسمیک، یک پروتئین غشایی ادغام شده است و بخش سوم یک کانال پروتئینی واقع در غشای خارجی می­باشد. این قسمت موجب خروج دارو از سیتوپلاسم به محیط خارج می­گردد.Mex B ژن مسئول تشکیل پروتئین آنتی پورتو پروتون- دارو در پمپ mex AB-oprM می­باشد. این پمپ عامل مقاومت به بتالاکتام­ها، فلوروکینولون­ها، تتراسایکلین­ها، ماکرولیدها، کلرامفنیکل­ها، نورپیوسین و تری­متوپریم می­باشد. همچنین قادر است طیف وسیعی از رنگ­ها، دترجنت­ها، مهار­کننده­های بیوسنتز اسید چرب، حلال­های مواد آلی را نیز تراوش نماید. کینولون­ها عوامل ضد باکتریایی وسیع الطیف خوراکی هستند که به صورت گسترده مورد استفاده درمانی قرار می­گیرند. این آنتی­بیوتیک­ها یک گروه جدید از آنتی­بیوتیک­های سنتزی هستند و مشتقاتی از نالیدیکسیک اسید می­باشد. کینولون­ها مولکول­های آب دوست کم وزنی هستند که همانند سازی DNA را بدون اثر بر روی سنتز RNA یا پروتئین در باکتری فلوروکینولون­ها به دلیل مهار دو آنزیم DNA ژیراز و توپوایزومراز 17 می­باشد.DNA ژیراز در باکتری های گرم منفی و توپوایزومراز 17 در باکتری­های گرم مثبت نسبت به فلوروکینولون ها حساس­تر می­باشند. هر دو این آنزیم­ها تترامر ولی با جفت زیر واحدهای متفاوت هستند. زیر واحدهای GyrA و GyrB از DNA ژیراز همولوگ ParC و ParE از توپوایزومراز 17 می­باشند. در میان نسل کینولون­ها از جمله سیپروفلوکساسین، نورفلوکساسین، لوفلوکساسین و اوفلوکساسین می­باشند که بر روی طیف وسیعی از باکتری­ها مؤثر هستند. سیپروفلوکساسین تنها فلوروکینولونی است که بالاترین اثر مهاری را علیه سودوموناس آئروژینوزا دارا می باشد. با این وجود توصیه نمی­شود که به عنوان تنها دارو برای درمان استفاده شود. زیرا این ارگانیسم به راحتی در مدت درمان مقاوم می­شود(8).بسیاری از نمونه­های کلینیکی سودوموناس آئروژینوزای مقاوم به ایمی­پنم فاقد OprD هستند. فقدان OprD مقاومت به کارباپنم­ها را ایجاد می­کند. انتخاب سویه­های سودوموناس آئروژینوزا با ایمی­پنم نسبت به درمان با سفتازیدیم، پیپراسیلین یا سیپروفلوکساسین رایج­تر است (Robert, Speert  2000).

مکانیسم های مقاومت نسبت به آمینوگلوکوزیدها

چندین گروه از مکانیسم­های مقاومت نسبت به آمینوگلوکوزیدها به شرح زیر است: تغییر آنزیم­ها، نفوذپذیری پایین غشاء خارجی، پمپ افلاکس و تغییر هدف (Robert, Speert  2000).

AMEs

AMEs به فسفات یا آدنیل مولکول آنتی بیوتیک اتصال می­یابد و بنابراین قدرت اتصال آنتی بیوتیک­ها را به هدف در سلول باکتری کاهش می­دهد. AMEs ها توسط پلاسمیدها کد می­شوند و به گروه تقسیم می شوند: آمینوگلیکوزید فسفوریل ترانسفراز (APHs)، آمینوگلیکوزید آدنیل ترانسفراز (ANTs یا AADs) و آمینوگلیکوزید استیل ترانسفراز (AACs). اغلب AMEs هایی که سودوموناس آئروژینوزا بیان می­کند به شرح زیر است : II AAC(6´)- که منجر به مقاومت نسبت به جنتامایسین، توبرامایسین می­شود.

I-AAC(3) که منجر به مقاومت نسبت به جنتامایسین می­شود، II-AAC(3) (مقاومت نسبت به جنتامایسین، توبرامایسین)، I- AAC(6´) (مقاومت به توبرامایسین و آمیکاسین) و I- ANT(2´) (مقاومت به جنتامایسین و توبرامایسین) (Robert, Speert  2000).

تغییر هدف

اخیراً متیلاسیون 16S rRNA ،یک مکانیسم مقاومتی در میان باکتری­های گرم منفی خانواده اینتروباکتریاسه و همچنین سودوموناس آئروژینوزا ایجاد کرده است. ژن­های دخیل در این فرآیند اغلب بر روی ترنسپوزون ها با یک پلاسمید قابل انتقال قرار گرفته اند. که این می تواند موجب گسترش جهانی این مکانیسم مقاومتی جدید شود. اولین آنزیم متیلاز 16S Rrna ، RmtA نامیده می­شود که اولین بار در سال 2003 از نمونه های کلینیکی سودوموناس آئروژینوزا s مقاوم به آمینوگلوکوزید در ژاپن گزارش شد. این آنزیم سطح بالایی از مقاومت را نسبت به تمام آمینوگلوکوزیدها از قبیل آمیکاسین، توبرامایسین، کانامایسین و جنتامایسین ایجاد می­کند. همچنین RmtD، در سال 2005 در برزیل از سویه­های مقاوم سودوموناس آئروژینوزا شناسایی شد. این آنزیم نیز علیه آمیکاسین، توبرامایسین و جنتامایسین مقاومت ایجاد می­کند (Robert, Speert  2000).

مکانیسم های غیر آنزیمی دخیل در ایجاد مقاومت نسبت به آمینوگلوکوزیدها

اخیراً ElʼGarch و همکارانش تأثیر مکانیسم­های غیر آنزیمی مختلف سودوموناس آئروژینوزا را بررسی کردند. یافته های آن­ها نشان می­دهد که افزایش میزان جهش در این باکتری منجر به افزایش تدریجی مقاومت نسبت به آمینوگلیکوزیدها می­شود. چهار ژن gal U ، nuo G ، mex Z ، rpl Y در ایجاد تدریجی مقاومت نسبت به آمینوگلوکوزیدها دخیل می باشند. ژن gal U در سودوموناس آئروژینوزا برای سنتز هسته ی LPS مورد نیاز است و غیر فعال شدن آن منجر به تولید مولکول های LPS فاقد باندهای A و B پلی ساکاریدی در باکتری می­شود. بر طبق مطالعه ای که Kadurugamuwa در سال1993 انجام داد مشخص گردید که فقدان باندهای A و B موجب تضعیف اتصال آنتی بیوتیک به سطح سلول و در نتیجه تضعیف عملکرد آن می­شود(7). بیان ژن جهش یافته nuo Gدر عملکرد اپران nuoABDEFGHIJKLMN که آنزیم نوع I ، NADH اکسی ردوکتاز را کد می کند اختلال ایجاد می­کند. غیرفعال سازی این آنزیم منجر به تحلیل رفتن انرژی منشأ شده و در نتیجه جذب آمینوگلوکوزید کاهش مییابد. غیر فعال شدن رپرسور ژن mexZ منجر به افزایش بیان ژن mexY و تولید بیش از اندازه ترانسپورتر MexY می­شود. همچنین سرکوب ژن rplY ، که پروتئین L25 ریبوزومی را کد می­کند منجر به افزایش عملکرد سیستم افلاکس MexXY-OPrM و حساسیت بالا نسبت به آنتی بیوتیک­های بتالاکتام میگردد. این نتایج نشان می­دهد که چطور سودوموناس آئروژینوزا به تدریج نسبت به آنتی بیوتیک­ها مقاوم می­شود (Robert, Speert  2000).