کتاب واکسن علیه بیماری سالمونلاتیفی

فهرست
عنوان صفحه
فصل 1 9
مقدمه 9
طبقه‌بندی و نام‌گذاری سالمونلا 16
واکسن‌شناسی 17
مکانیسم بیماری‌زایی 26
فصل 2 41
مطالعات 41
فصل 3 45
مواد، وسایل و دستگاههای مورد استفاده 45
مطالعه بیوانفورماتیکی 48
فصل 4 95
شناسایی پروتئین‌های سطحی 95
یافته‌های آزمایشگاهی 122
فصل 5 136
نتیجه‌گیری 136
منابع 147

بسیاری از باکتری¬ها هنگام رشد در خارج از دیواره سلولی خود پوششی متراکم با حدود مشخص به نام کپسول تولید می¬کنند. کپسول¬ها غالباً از جنس هموپلی ساکاریدی (در باسیلوس آنتراسیس و باسیلوس لیکنی فرمیس به صورت استثنا از جنس پروتئین) بوده و به دلیل اینکه در اکثر باکتری¬ها خاصیت آنتی‌ژنی دارد به آن آنتی‌ژن کپسولی مهاجم (Vi) گویند. از این آنتی‌ژن سطحی که بسیار محافظت‌شده می¬باشد، برای شناسایی و طبقه‌بندی باکتری¬ها استفاده می¬کنند (16). این آنتی‌ژن تنها در برخی از سروتیپ¬های سالمونلا تیفی، سالمونلا پاراتیفی C و سالمونلا دوبلین وجود دارند. آنتی‌ژن Vi با برانگیختن پاسخ ایمنی، باعث تولید آنتی‌بادی می¬شود. این آنتی‌بادی‌های تولیدشده علیه کپسول با پوشاندن سطح باکتری به فرآیند فاگوستیوز کمک می¬کنند (18). کپسول در تهاجم باکتری¬های بیماری‌زا دخالت داشته و از آن‌ها در برابر نامساعد محیطی (خشکی) و همچنین فاگوسیت شدن محافظت کند.
پروتئین غشا بیرونی (OMP)
باکتری¬های گرم منفی دارای دو غشا در سطح خود بوده که در حفاظت و تأمین مواد غذایی نقش دارند. بخش قابل توجهی از غشا بیرونی دارای پروتئین¬هایی تحت عنوان پروتئین¬های غشا بیرونی بوده که برخی از آن‌ها در غشا وارد شده درحالی‌که برخی دیگر به سطح غشا متصل شده و در اتصال و فعالیت¬های آنزیمی نقش دارند. همچنین این پروتئین¬ها در فعالیت‌های حیاتی سلول از جمله دریافت مواد غذایی، چسبندگی سلول، ارتباط‌های بین سلولی، دفع مواد زائد و … نقش دارند. حدود 3 درصد از ژنوم باکتری جهت بیان این نوع پروتئین¬ها کد می¬شوند. پروتئین¬های غشای خارجی در سیتوپلاسم ساخته شده و پس از فرستاده شدن به غشا خارجی ابتدا به کمک چاپرون¬ها و سایر عوامل موجود در غشا، ساختار اصلی خود را پیدا کرده و در غشا قرار می¬گیرند (20). این پروتئین¬ها به عنوان یک جز فعال در انطباق سلول¬های باکتریایی با نوسانات شرایط محیطی پیرامون باکتری نقش دارند. علاوه بر این، با توجه به اینکه آن‌ها بخش قابل توجهی از سطح سلول¬های باکتریایی را به خود اختصاص داده که برخی از آن‌ها در مهار و برخی دیگر در تقویت فعالیت باکتریلیتیک سیستم کمپلمان مؤثر هستند. برخی از پروتئین¬های غشا خارجی که با ورود به غشا کانال¬هایی را به وجود می¬آورند (پورین¬ها )، خاصیت آنتی‌ژنی داشته بطوریکه سیستم ایمنی پاسخ ایمنی محافظت‌کننده‌ای را علیه این پروتئین¬ها ایجاد می¬کند.
پیلی
پیلی (مفرد آن پیلوس ) لوله¬های توخالی خارج سلولی بوده که زیر واحدهای پروتئینی به نام پیلین تشکیل شده است.
ژن پیلوس اغلب روی پلاسمید باکتری قرار داشته و باکتری واجد پیلوس را (+F) یا باکتری نر و باکتری فاقد ژن پیلوس را به صورت (-F) یا باکتری ماده گویند. باکتری¬ها اغلب دارای دو نوع پیلوس بلند (پیلوس جنسی یا پیلوس F) و پیلوس کوتاه (فیمبریا ) هستند. پیلوس جنسی یا پیلوس F در انتقال ماده ژنتیکی از یک باکتری به یک باکتری دیگر در فرایند ادغام جنسی شرکت می¬کند. فیمبریا نقش¬های مختلفی از جمله اتصال باکتری به یک سطح (بافت میزبان)، تشکیل بیوفیلم، تهاجم سلولی، برهمکنش¬های ماکروفاژ و ایجاد سازگاری در میزبان بر عهده دارد (23-26). از بین عوامل بیماری‌زای مختلفی (سیستم ترشحی نوع سه، تاژک، کپسول، پلاسمیدها و ادهسین¬ها) که در سالمونلا شناسایی شده است، فیمبریا به عنوان جزئی از خانواده ادهسین¬ها نقش پررنگ‌تری را در بیماری‌زایی و تنوع در سالمونلا بازی می¬کند. فیمبریا در سویه¬های مختلف به اشکال مختلف بیان و مشاهده می¬شود. فیمبریا بر اساس شکل ظاهری و الگوهماگلوتیناسیون به هفت نوع (نوع 1 تا 6 و نوع F) طبقه‌بندی می¬شوند. با این وجود، طبقه‌بندی دیگری که بر اساس سرولوژیک می¬باشد بهتر توانسته ارتباط ژنتیکی آنتی‌ژن‌های فیمبریایی را پیش‌بینی کند. امروزه فیمبریا بر اساس روش سرهم‌بندی تقسیم‌بندی می¬شوند. پروتئین¬های موردنیاز جهت تشکیل سرهم‌بندی و تنظیم بیان ساختارهای سطحی دخیل در چسبندگی توسط یک خوشه ژنی فیمبریایی خاص متشکل از 15-4 ژن بیان می¬شوند (6،29). در ژنوم سالمونلا چندین خوشه ژنی فیمبریایی وجود دارند که به دلیل فعالیت¬های گسترده به خوبی ویژگی‌های آن‌ها معین نشده است.
طبقه‌بندی و نام‌گذاری سالمونلا
سالمونلا از گونه¬ها و زیرگونه¬های متعددی تشکیل شده که همین امر طبقه‌بندی آن را در گذشته با پیچیدگی¬هایی همراه کرده بود. در ابتدا سالمونلاها را بر اساس نوع بیماری که ایجاد می¬کردند (سالمونلا تیفی (S.typhi) که در انسان عامل تب تیفوئید بود)، موجودی که از آن جدا شده بودند (سالمونلا تیفی موریوم (S.Typhimurium)، سالمونلایی که از موش جدا شده بود) و یا موقعیت جغرافیایی که شناسایی شده بودند (S.Newport) طبقه‌بندی می¬کردند. در اوایل دهه 1970 آزمایش¬های مبتنی بر هیبریداسیون DNA-DNA نشان داد که سروتایپ‌های مختلف سالمونلا دارای بیش از 85 درصد اطلاعات ژنتیکی مشترک هستند. این نتایج همه سالمونلاهای شناسایی‌شده را در یک گونه قرار می¬داد. در سال 1986 ماینر و پاپاف برای این یک گونه نام سالمونلا انتریکا را پیشنهاد کردند که به طور گسترده مورد پذیرش محققان دیگر قرار گرفت (32). سپس گونه سالمونلا انتریکا بر اساس شباهت‌های موجود در ساختار DNA به هفت زیرگونه (I,II,IIIa,IIIb,IV,V,VI) طبقه‌بندی شدند که زیرگونه V فاصله ژنتیکی بیشتری با سایر زیرگونه¬ها داشت. در سال 1989 ریو و همکاران این زیرگونه (سالمونلا انتریکا زیرگونه بنگوری) را به عنوان یک گونه مستقل به نام سالمونلا بنگوری معرفی کردند (33). در سال 1996 مفهوم یک سروتایپ – یک گونه توسط کافمن مطرح و معیاری جهت طبقه‌بندی سالمونلا قرار گرفت. این معیار حتی امروزه توانایی تمایز 2500 گونه مختلف سالمونلا را داشته و برای تشخیص بالینی و سروتایپینگ سالمونلا مورد استفاده قرار می‌گیرد. بر همین اساس هرساله اطلاعات مربوط به این طبقه‌بندی توسط سازمان بهداشت جهانی به‌روز می‌شود. بر اساس طبقه‌بندی و نام‌گذاری سالمونلا که توسط مراکز مدیریت و پیشگیری بیماری (CDC) مورد استفاده قرار می‌گیرد، جنس سالمونلا از دو گونه سالمونلا انتریکا (S.enterica) و سالمونلا بنگوری (S.bongori) تشکیل شده است. بر اساس نام‌گذاری رومی، گونه سالمونلا انتریکا به شش زیرگونه طبقه‌بندی می¬شوند که در جدول 1 اسامی آن‌ها ذکر شده است (35). اکثر سروتایپ¬های تشکیل‌دهنده سالمونلا (59%) در اولین زیرگونه سالمونلا انتریکا (I) قرار دارند. مهم‌ترین گروه¬های سروتایپی O که در این زیرگونه دیده می¬شوند شامل A, B, C1, C2, D ,E بوده که عامل 99% عفونت‌های سالمونلایی در انسان¬ها و حیوانات خون گرم می¬باشد. سروتایپ¬های موجود در سایر زیرگونه¬ها و گونه سالمونلا بنگوری معمولاً در محیط و حیوانات خون‌سرد مشاهده شده و به ندرت در انسان ایجاد بیماری می¬کنند.
واکسن‌شناسی
واکسن‌شناسی مدت‌هاست که به عنوان یکی از بازوهای مهم پزشکی مدرن به شمار می¬رود. می‌توان از آن به عنوان تنها نوعی از روش درمانی نام برد که توانسته یک نوع خاص بیماری عفونی (آبله) را به‌طور کامل ریشه‌کن کند. اولین استفاده از واکسیناسیون مربوط به ادوارد جنر در سال 1796 برای مقابله علیه آبله می¬باشد. وی با کار خود بنیان‌گذار واکسن‌شناسی کلاسیک شد. روش¬های مدرن تولید واکسن نیز از ایدئولوژی این نمونه اولیه واکسیناسیون جهت توسعه واکسن¬هایی با پاسخ ایمنی پایداری استفاده می¬کنند. بطوریکه تحقیقات صورت گرفته در این زمینه منجر به تولید واکسن¬هایی شده که توانسته¬اند تعداد زیادی از بیماری¬های عفونی را کنترل کنند. پیشرفت‌های صورت گرفته در زمینه تولید واکسن منجر به نجات جان میلیون¬ها نفر در سال می¬شود. با ظهور سویه¬های مقاوم به درمان و عدم توانایی واکسن¬های موجود در ایجاد محافظت علیه آن‌ها، این معادله در حال به هم خوردن می¬باشد.

با این حال هنوز هم پذیرش گسترده¬ای وجود دارد که واکسن شناسی یکی از مقرون به‌صرفه‌ترین و پایدارترین روش¬ها برای کنترل بیماری¬های عفونی موجود و بیماری¬های ناشی از سویه¬های مقاوم به درمان می¬باشد. امید است با توجه بیشتر به تحقیق و توسعه در زمینه تولید واکسن، بیماری¬هایی مانند ایدز، مالاریا و سل از طریق واکسیناسیون به‌طور کامل قابل پیشگیری شوند و شیوع پاتوژن¬های مقاوم نیز کاهش یابد.
برای تولید واکسن مؤثر، درک چگونگی پاسخ سیستم ایمنی به عوامل بیماری‌زا جهت ایجاد محافظت بسیار حائز اهمیت می¬باشد. به همین دلیل در این بخش به طور خلاصه در مورد چگونگی پاسخ سیستم ایمنی بدن انسان به عفونت توضیح داده خواهد شد. سیستم ایمنی جهت مبارزه با عوامل بیماری‌زا به دو صورت پاسخ می‌دهد که شامل:
پاسخ¬های ایمنی ذاتی
پس از ورود عوامل بیماری‌زا، در ابتدا پاسخ¬های مرتبط با ایمنی ذاتی فعال می¬شوند. پاسخ-های ایمنی ذاتی برخلاف پاسخ¬های ایمنی اکتسابی به صورت غیراختصاصی بوده و به سرعت در مواجه با عوامل بیماری‌زا فعال می¬شوند. همچنین این نوع پاسخ¬ها نقش مهمی را در فعال‌سازی پاسخ¬های مرتبط با ایمنی اکتسابی بازی می¬کنند. سیستم ایمنی ذاتی با استفاده از سیستم کمپلمان عوامل بیماری‌زا را از بین می¬برند. سیستم کمپلمان مجموعه¬ای از پروتئین¬ها هستند که در خون یافت می¬شوند و بلافاصله پس از ورود عوامل بیماری‌زا نسبت به از بین بردن آن‌ها اقدام می¬کنند. فعال شدن سیستم کمپلمان باعث شروع یک مسیر آنزیمی می¬شود که با فراخوانی سلول¬های التهابی، ایجاد منافذ در غشا دولایه، باعث تخریب پاتوژن¬ها و در نهایت از بین بردن سلول¬های بیماری‌زا می¬شوند. علاوه بر سیستم کمپلمان ایمنی ذاتی از طریق فرایندی به نام فاگوسیتوز توس نوتروفیل¬ها و ماکروفاژ¬ها نیز نسبت به از بین بردن عوامل بیماری‌زا اقدام می¬کند. سیستم ایمنی ذاتی با استفاده از مولکول¬هایی به نام گیرنده¬های تشخیص الگو (PRRS)، الگوهای مولکولی مرتبط با پاتوژن (PAMPS) را شناسایی می¬کند. هنگامی‌که سلول¬های آلوده به پاتوژن توسط سیستم ایمنی ذاتی شناخته می¬شود، التهاب اطراف آن‌ها را فرامی‌گیرد. التهاب ناشی از فعال شدن سلول¬های ماکروفاژ به علت انتشار سیتوکین¬ها و کموکین¬ها پس از فعال شدن PRR می¬باشد. انتشار کموکاین¬ها و سیتوکین¬ها باعث فعال‌سازی پاسخ¬های مرتبط با سیستم ایمنی اکتسابی نیز می¬شوند (38). مسیرهای بسیاری جهت فعال‌سازی پاسخ¬های مرتبط با ایمنی اکتسابی وجود دارد. یک مسیر متداول از طریق سلول¬های ارائه‌دهنده آنتی‌ژن (APC) تخصصی مانند سلول¬های دندریتیک می¬باشد. سلول¬های دندریتیک از طریق PRRهایی به نام TLR به PAMPها پاسخ می¬دهند (38). آن‌ها باکتری¬ها را فاگوسیتوز کرده و آنتی‌ژن‌ها را بر روی سطح سلول¬های دندریتیک توسط مجموعه سازگاری بافتی اصلی (MHC) در معرض قرار می¬دهند. دو نوع MHC به نام¬های MHC-I و MHC-II وجود دارد. سلول¬های دندریتیک آنتی‌ژن‌ها را توسط مولکول MHC-II بر روی سطح خود عرضه می¬کنند. به همین دلیل به آن‌ها APC تخصصی اطلاق می¬شود. هنگامی‌که سلول¬های دندریتیک در مواجه با عوامل بیماری‌زا فعال می¬شوند، به گره¬های لنفاوی مهاجرت کرده و از طریق سیستم لنفاوی سلول¬های لنفوسیت T کمک‌کننده CD4 را فعال می¬کند. سلول¬های دندریتیک با آنتی‌ژن که توسط مولکول¬های MHC-II در سطح خود عرضه کرده به گیرنده سلول¬های T کمک‌کننده CD4 غیرفعال متصل و آن‌ها را فعال می¬کند.
پاسخ¬های ایمنی اکتسابی
اگرچه پاسخ ایمنی اکتسابی نسبت به پاسخ ایمنی ذاتی کندتر می¬باشد، اما برای هر آنتی‌ژن خاص اختصاصی عمل کرده و همچنین دارای «خاطره» می¬باشد. به این معنی که پس از یک‌بار مواجه با یک پاتوژن، در برخوردهای بعدی پاسخ سریع‌تر و قوی¬تر نشان خواهد داد (39). پاسخ ایمنی اکتسابی را می¬توان در دو بخش ایمنی همورال و ایمنی سلولی بررسی کرد.
ایمنی سلولی متشکل از دو نوع سلول T شامل CD4, CD8 می¬باشد. سلول¬های CD8 (سلول‌های T کشنده ) و سلول¬های CD4 (سلول¬های T کمک‌کننده ) در ایمنی سلولی و همورال شرکت می¬کند. تمام سلول¬های T از طریق گیرنده¬های خود، آنتی‌ژن‌هایی را شناسایی می¬کنند که توسط مولکول MHC پردازش و در سطح سلول عرضه می¬شوند. گیرنده¬های همه سلول¬های T به نواحی اتصالی که به صورت تصادفی ایجاد شده و توسط مولکول¬های MHC در سطح قرار گرفته، متصل می¬شوند. این امر باعث پاسخ اختصاصی به یک پاتوژن خاص می¬شود. برخلاف پاسخ ایمنی ذاتی که به‌طور کلی PAMPS باکتریایی را شناسایی می¬کنند. سلول¬های CD8 توانایی شناسایی آنتی‌ژن‌های عرضه‌شده در سطح مولکول¬های MHC کلاس I (MHC-I) را دارند. مولکول¬های MHC کلاس I بر روی تمام سلول¬های هسته‌دار یافت می¬شوند. هنگامی‌که سلول¬های CD8 (T-cytotoxic) از طریق گیرنده¬های خود به آنتی‌ژنی که توسط مولکول MHC کلاس I عرضه شده متصل شده و فعال گردد، آن سلول و همۀ سلول¬هایی که روی سطح آن‌ها این آنتی‌ژن عرضه شده باشد را سلول آلوده تلقی کرده و از بین می¬برد. سلول¬های CD4 که از دو دسته Th1, Th2 تشکیل شده، توانایی شناسایی آنتی‌ژن‌های عرضه‌شده در سطح مولکول¬های MHC کلاس II (MHC-II) را دارند. سلول¬های Th1 از طریق تولید مواد شیمیایی مانند اینترفرون گاما موجب فعال شدن پاسخ ایمنی سلولی می¬شوند. همچنین سلول¬های Th1 به سلول¬های خاطره T تبدیل می¬شوند که می¬توانند برای مدت طولانی در بدن حضور داشته و در صورت ورود مجدد عامل بیماری‌زا با سرعت و قدرت بیشتری به آن‌ها پاسخ دهند.
در ایمنی همورال، سلول¬های فعال‌شده Th2، باعث تمایز سلول¬های لنفوسیت B به سلول-های پلاسما (سلول¬های تولیدکننده آنتی‌بادی) و سلول¬های خاطره B می¬شوند. آنتی‌بادی‌های تولیدشده توسط سلول¬های پلاسما می¬توانند به آنتی‌ژن‌های (فرم اصلی آنتی) پاتوژن متصل شوند. آنتی‌ژن‌هایی که آنتی‌بادی به آن‌ها متصل می¬شود برخلاف آنتی‌ژن‌هایی که سلول¬های T به آن‌ها متصل می¬شوند، نیاز به پردازش و عرضه شدن توسط مولکول¬های MHC را ندارند (40). آنتی‌بادی‌هایی که سلول¬های پلاسما در ابتدا تولید می¬کنند از نوع IgM می¬باشد. سپس با افزایش تعداد سلول¬های پلاسما، بجای IgM آنتی‌بادی IgG تولید می¬کنند که توانایی اتصال با اختصاصیت بیشتری را به آنتی‌ژن‌ها دارند. آنتی‌بادی‌ها با اتصال به آنتی‌ژن پاتوژن، آن‌ها را علامت‌گذاری کرده تا توسط سایر اجزا سیستم ایمنی (فاگوسیت¬ها (نوتروفیل¬ها و ماکروفاژها) و سیستم کمپلمان)، شناسایی و تخریب شوند. از طرف دیگر به دلیل تولید سلول¬های خاطره B و T که توسط سلول¬های Th تولید می¬شوند، سرعت و قدرت واکنش ایمنی در مواجه با پاتوژن¬های مشابه بیشتر خواهد بود. هدف از واکسن نیز تولید چنین ایمنی طولانی‌مدت از طریق تشکیل سلول¬های اختصاصی خاطره T, B می¬باشد. این مهم از طریق تحریک قوی پاسخ ایمنی ذاتی و اکتسابی قابل دستیابی می¬باشد.