کتاب سلول‌های ‏بنیادی ‏و ‏بیماران ‏دیابتی

فهرست
عنوان صفحه
مقدمه 8
فصل اول 11
بیماری دیابت 11
لنتی ویروس 13
سلول‌های بنیادی 17
انواع سلول‌های بنیادی 18
روش‌های تولید سلول پرتوان 22
فاکتورهای مربوط به پرتوانی 33
پتانسیل کاربردی سلول‌های iPS 37
موانع و مشکلات استفاده از سلول‌های iPS برای درمان 40
فصل دوم 43
کشت سلول 43
بافر نمکی فسفات 43
ژلاتین 44
محیط کشت سلول 44
تیتراسیون ويروس 54
بخش مولکولی 65
استخراج RNA 71
الکتروفورز ژل آگارز 74
فصل سوم 83
استخراج و تایید DNA های پلاسمیدی 83
تولید لنتی ویروس و آلوده سازی سلول فیبروبلاست بیمار دیابتی 84
تعیین تیتر لنتی ویروس‌های بیان‌کننده‌ی GFP 86
برداشت کلونی‌های سلولی 89
تکثیر سلول‌های برداشت‌شده 89
بررسی بیان در سطح رونویسی 90
مقایسه کمی بیان ژن‌های پرتوانی با استفاده از واکنش Real-time PCR 97
بررسی بیان در سطح پروتئین 100
بررسی کاریوتایپ سلول‌های iPS 105
تولید اجسام شبه جنینی و تمایز خود به خودی کلون‌ها 106
بحث و نتیجه‌گیری 108
منابع 116

بیماری دیابت
بیماری دیابت، یک بیماری متابولیک است. در این بیماری، سرعت و توانایی بدن در استفاده و سوخت‌وساز کامل قندها کاهش می‌یابد، به همین دلیل میزان قند خون افزایش می‌یابد.
در تعریف سازمان بهداشت جهانی، بدن بیمار دیابتی یا دچار کمبود انسولین است یا انسولین تولیدی را به‌درستی مصرف نمی‌کند. انسولین هورمونی است که برای تبدیل قند، نشاسته و کربوهیدرات به انرژی موردنیاز در سلول‌های بدن ضروری و موردنیاز است. عوامل به وجود آورنده‌ی دیابت هنوز هم ناشناخته است. البته عوامل ژنتیکی، چاقی و کم‌تحرکی نقش مهمی در ابتلای فرد به دیابت دارند.
دیابت نوع یک
بدن مبتلایان به دیابت نوع یک که اغلب در سنین زیر ۳۰ سالگی نمایان می‌شود، توانایی تولید انسولین را ندارد و این امر موجب افزایش سطح قند خون می‌شود. این امر به دلیل از دست رفتن سلول‌های β جزایر لانگرهانس پانکراس اتفاق می‌افتد. دلیل اصلی از دست رفتن سلول‌های β، حمله‌ی سلول‌های لنفوسیت T به دلیل خود ایمنی است که در بیشتر موارد بروز بیماری به دنبال ابتلا به یک بیماری ویروسی اتفاق می‌افتد. درمان به‌صورت تزریق انسولین و کنترل دائمی میزان قند خون می‌باشد. از علائم دیابت نوع اول می‌توان تشنگی بیش‌ازحد، گرسنگی دائمی، تکرر ادرار (به‌خصوص در شب)، کاهش وزن ناگهانی، خستگی مفرط و تاری دید را نام برد.

دیابت نوع دوم
در این نوع دیابت، بدن فرد مبتلا انسولین تولید می‌کند و حتی ممکن است غلظت انسولین در خون از مقدار معمول آن نیز بیشتر باشد، اما گیرنده‌های سلولی فرد نسبت به انسولین مقاوم شده در حقیقت نمی‌گذارند انسولین وارد سلول‌ها شده و اعمال طبیعی خود را انجام دهند. در این حالت می‌توان با درمان رژیمی و ورزش، غلظت قند خون را کاهش داد.
انسولین در سال ۱۹۲۱ به‌عنوان عامل هیپوگلایسمی کشف شد و متعاقب آن مورد خالص‌سازی قرار گرفت و نشان داده شد که این هورمون باارزش‌ترین ترکیب، به‌منظور درمان بیماری دیابت است. بااینکه انسولين حدود ۹۰ سال است که در دسترس است و با توجه به پیش‌بینی دو برابر شدن مرگ‌ومیر در ارتباط با این بیماری بین سال‌های ۲۰۰۵ تا ۲۰۳۰ و با توجه به این حقیقت که حدود ٪۶ از کل بودجه‌ی بهداشت و درمان صرف این بیماری می‌شود؛ بسیار تعجب‌آور است که مؤثرترین درمان این بیماری یعنی انسولین به‌صورت گسترده مورداستفاده قرار نمی‌گیرد و این بیماری به‌صورت همه‌گیر در جهان درآمده است.
انسولین درمانی به دلیل ناراحتی و عوارض وخیم تزریق این دارو، خوشایند نیست و بنابراین در طول دهه‌های اخیر، برای انتقال انسولین به توسعه‌ی مسیرهای جایگزین، تمرکز کرده‌اند. روش تزریق انسولین (روش تهاجمی) به دلیل ترس از سوزن، درد، برآمدگی‌های پوستی، واکنش‌های آلرژیک، عفونت‌های رایج، استرس‌های ایجادشده به دلیل رژیم‌های سخت و طولانی‌مدت، باعث رنج بیماران و عدم سازگاری آنها با این روش درمانی شده است. همچنین تزریق انسولین باعث انتقال دارو به بافت‌های هدف اشتباه، فارماکودینامیک ضعیف و حتی باعث افزایش وزن می‌شود.
امروزه تحقیقاتی برای درمان دیابت نوع ۱ انجام‌شده است که در آنها بازسازی و یا انتقال بافت پانکراس برای جایگزینی سلول‌های β تخریب‌شده، استفاده‌شده است. هرچند این روش‌ها با دو مشکل اساسی مواجه است که یکی تولید میزان مناسب سلول‌های β است که انسولین را به میزان کافی بسازند و در پاسخ به سیگنال‌های فیزیولوژیکی آن را آزاد کنند و دیگری محفوظ ماندن این سلول‌ها از پاسخ ایمنی بدن بیمار می‌باشد. البته این تکنیک‌ها به‌صورت کلنیکی قابل‌استفاده نیستند. به همین دلیل، به نظر می‌رسد که سلول درمانی روشی مطمئن‌تر و کارآمدتر از انتقال بافت است.
لنتی ویروس
لنتی ویروس‌ها جزو خانواده‌ی Retroviridae هستند. سیستم لنتی ویروسی می‌تواند با کارایی بالا سلول‌های در حال تقسیم و سلول‌هایی را که در حال تقسیم نیستند، آلوده سازد. چرخه‌ی آلوده سازی ویروس نقص ایمنی انسان (HIV-1 )، بااتصال ویریون از طریق گلیکوپروتئین سطح ویروس به سلول هدف، آغاز می‌شود. بعد از ادغام غشا، هسته‌ی ویروس به سیتوسل وارد می‌شود و پس از طی یک سری وقایع، غشای هسته حذف می‌شود. این مراحل جهت تشکیل کمپلکس نوکلئوپروتئین ویروسی که در رونویسی معکوس، انتقال به هسته و ورود می ویروسی به ژنوم میزبان و ایجاد پروویروس نقش دارد، ضروری هستند.
ذرات ویروسی HIV-1 شامل 9/2 kb ژنوم ی دیپلوئید، پروتئین‌های ساختاری (gag )، پوششی (env )، آنزیمی (pol) و پروتئین‌های فرعی داخل پوششی که از غشای لیپیدی سلول میزبان گرفته‌شده، گلیکوپروتئین‌های روی سطح پوشش که در ورود به سلول هدف نقش دارد، می‌باشند.
ژنوم HIV-1 شامل سکانس بسته‌بندی (ψ)، تکرارهای انتهایی (LTR) در انتهای ۳ و ۵ ژنوم ویروسی است که عناصر پروموتر / تقویت‌کننده ، ژن‌های gag (ماتریکس، کپسید و نوکلئو کپسید)، ژن‌های pol (ترنس کریپتاز معکوس، اینتگراز و پروتئاز)، ژن‌هایenv (گلیکوپروتئین‌های سطحی و پروتئین درون غشایی) و ژن‌های فرعی (at، rev، nef، vif، vpr و vpu) را بیان می‌کنند.
ماده‌ی ژنتیکی لنتی ویروس دارای دو منطقه‌ی LTR در دو سمت ۳ و ۵ به طول ۶۰۰-۹۰۰ نوکلئوتید است. مناطق LTR جهت همانندسازی، ادغام در ژنوم میزبان و بیان ژن‌های ویروسی بسیار حائز اهمیت هستند.
نواحی شامل ۳ ناحیه‌ی زیر است:
-U3 (unique sequence at 3-end)
-R (repeat sequence)
-U5 (unique sequence at 5-end)
نقطه آغاز رونویسی از ژن‌های ویروسی (PBS) در منطقه‌ی R قرار دارد. پروموتر ژن‌های ویروسی و عناصر تقویت‌کننده در منطقه‌ی U3 واقع‌شده و این مناطق، توالی‌های ویژه‌ای جهت واکنش با پروتئین‌های تنظیمی تشکیل می‌دهند. با ورود ویروس به سلول میزبان و حذف پوشش پروتئین‌های ساختاری، RNA ی تک‌رشته‌ای ویروس توسط ترنس کرییتاز معکوس به DNA ی دو رشته‌ای تبدیل‌شده، وارد هسته می‌شود و به‌واسطه‌ی پروتئین‌های اینتگراز به کروماتین سلول میزبان وارد می‌شود. RNA رونویسی شده می‌تواند به‌صورت ژنوم ویروسی کامل وارد ویریون جدید شده و یا اینکه به پروتئین‌های ویروسی ترجمه شود، به‌محض گردهمایی پروتئین‌های ویروسی در سیتوپلاسم سلول آلوده‌شده، پروتئین‌های پوشش (env) ویروسی سبب ادغام غشای ویروس با غشای سلول میزبان شده و ویروس به خارج از سلول میزبان جوانه می‌زند.
وکتورهای لنتی ویروسی
وکتورهای لنتی ویروسی به دلیل ظرفیت بسته‌بندی بالا و توانایی آلوده سازی انواع مختلف سلول‌ها، ابزار قدرتمندی برای انتقال ژن به شمار می‌روند.
وکتورهای لنتی ویروسی ویژگی‌هایی دارند که سبب برتری آنها برای انتقال ژن با اهداف بالینی می‌شود. وکتورهای لنتی ویروسی قادر به پذیرش قطعه‌ی insert بزرگ‌تری هستند
(kb ۸ترنس ژن + تمام سیگنال‌های cis-acting موردنیاز). در مقایسه با وکتورهای آدنوویروسی و ویروس‌های وابسته به ادنوویروس‌ها، دارای خاصیت ایمنی‌زایی کمتری هستند. کارایی آلوده سازی وکتورهای النتی ویروسی بالاتر است. وکتورهای لنتی ویروسی توانایی آلوده سازی سلول‌های غیرفعال و خاموش را دارند که مسئله‌ی مهمی برای انتقال ژن به سلول‌های تمایزیافته مثل نورون‌ها، سلول‌های شبکیه و سلول‌های کبدی محسوب می‌شود. لنتی ویروس‌ها برخلاف رتروویروس‌ها ازنظر مکان نفوذ، به‌صورت انتخابی عمل کرده و در جایگاه‌هایی که از نظر ژنتیکی فعال‌اند، ادغام می‌گردند. لذا از نظر احتمال تومورزایی نیز مطمئن‌تر هستند.
محققان، برای ساخت وکتورهای لنتی ویروسی، ژن‌های فرعی را حذف کرده تا خاصیت بیماری۔ زایی ویروس را از بین ببرند. همچنین ژنوم ویروسی را حداقل به سه قالب خواندن، روی سه پلاسميد جدا تقسیم کرده‌اند، تمام عناصر سیس از یک پلاسمید و پروتئین‌های پوشش و بسته‌بندی از دو یا تعداد بیشتری پلاسمید بیان می‌شوند. ذرات ویروسی تولیدشده به این روش می‌توانند به سلول هدف وارد شوند، اما RNA ی پوشش و بسته‌بندی برای همانندسازی در آنها را ندارند.
ویروس HIV به‌طور طبیعی تمایل خاصی جهت ورود به برخی از سلول‌های بدن را دارد (ترو پیسم اختصاصی)، جهت حذف این نقص و امکان ورود وکتور لنتی ویروسی به تمام سلول‌های بدن، ژن گلیکوپروتئینی به نام VSV-G را جایگزین پوشش ویروس HIV نموده‌اند. این گلیکوپروتئین برای انواع سلول‌های بدن گیرنده دارد.
تغییر دیگر، حذف پروموتر طبیعی وکتور موجود در LTR می‌باشد که به‌موجب آن، بعد از رونویسی معکوس، فقط بیان یک پروموتر درونی مهندسی‌شده ادامه می‌یابد و از بیان RNA ی کامل جلوگیری می‌شود. درواقع با این تغییرات از بیماری‌زایی و تقسیم ویروس جلوگیری می‌شود.
توانایی ورود وکتورهای لنتی ویروسی به ژنوم میزبان، مزیت بیان پایدار ژنوم را در سلول‌های در حال تقسیم دارد، اما خطر جهش‌زایی در جی وجود دارد. با توجه به تحقیقات انجام‌شده، اثبات‌شده است که برای انجام باز برنامه‌ریزی، لازم نیست وکتور به جایگاه خاصی از ژنوم وارد شود، بنابراین با ورود جهت‌دهی شده‌ی وکتور به جایگاه‌های کروموزومی که مشکل‌ساز نیست، یا با جلوگیری از ورود به ژنوم میزبان، می‌توان خطر رویداد سرطان را کاهش داد.

ژنوم گونه‌ی وحشی به سه پلاسمید تقسیم‌شده است، پلاسمید بیان‌کننده‌ی پوشش، پلاسمید بیان‌کننده‌ی پروتئین‌های آنزیمی و ساختاری ویروس و پلاسمید بیان‌کننده‌ی ژن خارجی موردنظر پلاسمید انتقالی). ژن‌های فرعی و بیماری‌زا حذف‌شده‌اند.
تولید وکتور لنتی ویروسی غیر داخل شونده به ژنوم
جهت ورود DNA ی ویروسی به ژنوم میزبان، اینتگراز به ناحیه‌ی att واقع در LTR ها متصل شده و سبب اتصالات والان DNA ی دو رشته‌ای ویروسی و DNA ی ژنومی سلول می‌شود.
ساده‌ترین روش برای جلوگیری از ورود ژنوم ویروس به ژنوم میزبان، ایجاد جهش در مکان‌های اتصال اینتگراز ، واقع در انتهای ۳ و ۵ ژنوم وکتور که att site نام دارند، یا ایجاد جهش در ژن اینتگراز وکتور است. چندین جهش کارآمد برای ایجاد نقص در اینتگراز در رزیدوهای D64،D116 و E152 مربوط به دامین اصلی کاتالیتیک اینتگراز شناسایی‌شده‌اند.
ایجاد جهش در اینتگراز به‌گونه‌ای است که cDNA ژنوم ویروسی می‌تواند وارد هسته شود، ولی ژنوم ویروسی به ژنوم میزبان وارد نمی‌شود.
وکتورهای ویروسی غیر داخل شونده به ژنوم میزبان، با اینکه سبب کاهش خطر جهش‌زایی در جی می‌شوند، ولی نمی‌توانند به‌طور کامل از وقوع آن جلوگیری کنند. درواقع، ورود به ژنوم میزبان (یکی از هر 4*105-5*103 ذرات ویروسی واردشده به سلول) به میزان کمی در وکتورهای با نقص اینتگر از مشاهده می‌شود. مطالعات نشان داده که ادغام شدن با ژنوم میزبان به دلیل فعالیت اینتگراز نیست، بلکه به نظر می‌رسد به دلیل نوترکیبی همولوگ یا اتصال انتهای غیر همولوگ بین ژنوم وکتور غیر اینتگره شونده و DNA ی کروموزومی است.
سلول‌های بنیادی
سلول‌های بنیادی سلول‌هایی هستند که دارای ویژگی خودتکثیری و توانایی تولید سلول‌های تمایزیافته هستند. به‌عبارت‌دیگر، می‌توانند سلول‌های دختر مشابه مادر تولید کنند.
(خود تکثیری ) و همچنین سلول‌های با پتانسیل محدودتر تولید کنند (سلول‌های تمایزیافته).
سلول‌های بنیادی بر اساس توان تمایز به چند دسته تقسیم می‌شوند. سلول‌های بنیادی همه توان ، می‌توانند به انواع سلول‌های رویانی و خارج رویانی تمایز یابند. چنین سلول‌هایی می‌توانند یک موجود کامل و زنده را ایجاد کنند. این سلول‌ها از ادغام سلول‌های تخم و اسپرم به وجود می‌آیند. سلول‌های ساخته‌شده از چند تقسیم ابتدایی تخم بارورشده نیز همه توان هستند.
سلول‌های بنیادی پرتوان : سلول‌های نسل بعد از سلول‌های همه توان هستند و می‌توانند به سلول‌های رویانی، یعنی سلول‌های مشتق از سه لایه‌ی جنینی تمایز یابند.
سلول‌های بنیادی چند توان : می‌توانند به چند نوع سلول تمایز یابند، ولی فقط سلول‌هایی که از یک خانواده‌ی نزدیک و مرتبط هستند.
سلول‌های بنیادی کم‌توان می‌توانند فقط به تعداد کمی از سلول‌ها تمایز یابند، مثل سلول‌های بنیادی لنفوئیدی یا مغز استخوان.
سلول‌های تک توان :تنها می‌توانند یک نوع سلول مشابه خودشان را تولید کنند، ولی دارای ویژگی خود تکثیری هستند که آنها را از سلول‌های غیر بنیادی مثل سلول‌های ماهیچه‌ای تمایز می‌دهد.