کتاب ثاثیر ‏داروی ‏دوکسوروبیسین ‏بر ‏miRNA ‏ها ‏در ‏سرطان ‏پستان ‏سیروس ‏طریقی

فهرست
عنوان صفحه
فصل 1 9
کلیات 9
سرطان پستان 10
ژن‌های موثر درایجاد سرطان پستان 11
روش‌های تشخیص سرطان پستان 14
مسیرهای انتقال پیام در سرطان 16
انواع سرطان پستان 25
داروی دوکسوروبیسین 31
اگزوزوم 33
میکرو RNA 39
بیوژنز miRNA 39
عملکرد بیولوژیکی miRNA 41
مکانیسم عملکردی miRNA 41
عملکرد miRNA در سرطان 43
روش‌های درمانی با miRNA 44
روش‌های شناسایی miRNA 47
اهمیت و ضرورت انجام پروژه 51
جنبه جدید بودن و نوآوری 52
فصل 2 55
مطالعات 55
فصل 3 61
مواد و روش ها 61
تهیه و کشت سلولی 61
آزمون MTT برای بررسی بقای سلولی 62
تیمار سلولی با داروی دوکسوروبیسین 64
جدا سازي اگزوزوم از محیط کشت سلولی با استفاده از رسوب گذاري با محلول کيت Exoquick 64
ميکروسکوپ الکتروني نگاره (SEM) 64
استخراج RNA از اگزوزوم / سلول 65
ارزیابی کمی RNA استخراج شده 66
واکنش زنجیره‌ای پلیمراز کمی در زمان واقعی (Real-time PCR) 70
واکنش Real-time PCR؛ مخلوط واکنشی و شرایط دمایی و زمانی 73
آنالیز داده ها با استفاده از روش مقایسه ای چرخه آستانه 75
آنالیز آماری داده ها 76
فصل 4 77
نتایج 77
بررسی های بیوانفورماتیکی 80
کشت رده سلول‌های سرطانی پستان MCF-7 81
مشاهده اگزوزوم های جدا شده از محیط کشت رده سلولی سرطان پستان MCF-7 توسط میکروسکوپ الکترونی نگاره 83
بررسی کمی RNA تام استخراج شده 84
تعیین اختصاصیت واکنش Real-time PCR با استفاده از ارزیابی منحنی ذوب 84
فصل 5 91
نتیجه گیری 79
منـابع و مآخـذ 97

سرطان پستان رشد مهار نشده‌ی سلول‌های غیرطبیعی است که در بافت‌های مختلف پستان مانند مجاری‌ای که شیر را انتقال می‌دهند، در بافت تولیدکننده‌ی شیر و یا در بافت غیر غددی رخ می‌دهد. سرطان پستان پس از سرطان پوست دومین سرطان شایع در زنان است؛ اما سرطان پستان تنها مختص زنان نبوده بلکه مردان نیز درخطر ابتلا به آن هستند. از عوامل مستعد کننده در ابتلا به سرطان پستان می‌توان به نقش فاکتورهای ارثی و ژنتیکی اشاره نمود. یک‌سوم از کل مبتلایان دارای سابقه مثبت وقوع سرطان پستان در یک نفر یا تعداد بیشتری از وابستگان درجه اول یا دوم خود هستند. سرطان تکثیر تصاعدی کنترل نشده‌ی سلول‌هاست. تکثیر سلول‌های بدن در حالت طبیعی تحت کنترل بسیار دقیق مکانیسم‌های مرتبط با چرخه تقسیم سلولی است و این مکانیسم‌ها توسط ژن‌های متعددی کنترل می‌شوند. به وجود آمدن اختلال در ژن‌های کنترل‌کننده چرخه تقسیم سلولی سبب خارج شدن این مکانیسم‌ها از مسیر طبیعی خود می‌شود و بدین‌جهت است که در سطح سلولی تمامی انواع سرطان‌ها را اختلال ژنتیکی می‌نامند و این بدین معنی است که ایجاد جهش در ژن‌های کنترل‌کننده تکثیر سلولی سبب به وجود آمدن سرطان می‌گردد (6). از مهم‌ترین ژن‌های تأثیرگذار در ایجاد سرطان پستان می‌توان به سه گروه مهم اشاره نمود:
۱_ ژن‌هایی که در تسریع تکثیر سلول‌ها نقش دارند که انکوژن نامیده می‌شوند.
۲_ ژن‌های سرکوبگر تومور که باعث مهار تکثیر سلولی می‌شوند.
۳_ ژن‌های ترمیم‌کننده DNA که در صورت وقوع جهش در انکوژن باعث ترمیم آن‌ها می‌شود(7).
ژن‌های مؤثر در ایجاد سرطان پستان
BRCA1 و BRCA2 مستعدترین و شناخته‌شده‌ترین ژن‌های ابتلا به سرطان پستان متعلق به خانواده ژنی سرکوبگر تومور می‌باشند و چندین عملکرد سلولی شامل نقش حیاتی در تعمیر DNA همولوگ ، تأمین ثبات و پایداری DNA و کمک به پیشگیری از رشد غیر کنترل‌شده سلولی دارند. جهش در BRCA1 و BRCA2 منجر به عدم ثبات ژنوم و درنهایت تغییر در ژن‌های کلیدی ديگری شامل ژن‌های سرکوبگر تومور يا انکوژن ها می‌گردد. ناقلین جهش ژن‌های BRCA1 وBRCA2 ۱۰ تا ۲۰ برابر احتمال بیشتری برای ابتلا به سرطان پستان دارند. جهش در اين ژن‌ها می‌تواند از نوع جهش در سلول‌های رده زايا، جهش‌های سوماتیک و متیلاسیون پروموتر باشد که در کل مناطق کد کننده و در نواحی پیرایش يافت می‌شوند. اکثريت اين جهش‌ها، اضافه شدن‌ها و يا حذف‌های کوچکی می‌باشد که منجر به تغییر قالب، جهش‌های بی‌معنی يا تغییرات جايگاه پیرايش می‌شود. الگوی توارث جهش‌های ژنی BRCA به‌صورت اتوزومی غالب بوده و با شانس برابری به هردو جنس دختر و پسر به ارث می‌رسد اما سرطان پستان در مردان بیماری نادری است و در نتیجه ممکن است مردان فقط ناقلین جهش باشند. ژن BRCA1 نخستین ژن پرنفوذ عامل سرطان می‌باشد که جهش در آن احتمال ابتلا به سرطان پستان و تخمدان را افزايش می‌دهد. اين ژن در روی کروموزوم 17q21.31 به طول 10 کیلو جفت باز از DNA ژنومی قرار دارد و دارای 22 اگزون کد کننده و 2 اگزون غیر کدکننده است و پروتئینی با 1103 اسیدآمینه را تولید می‌کند. بیش از 500 نوع جهش متفاوت در این ژن شناسایی‌شده که شامل جایگزینی‌های تک نوکلئوتیدی ، حذف و الحاق می‌باشد. ژن BRCA2 به‌عنوان دومین ژن پرنفوذ است که روی کروموزوم 13q13.1 به طول 10 کیلو جفت باز از DNA ژنومی قرار دارد. اين ژن دارای 21 اگزون می‌باشد که يک پروتئین 3411 اسیدآمینه‌ای را کد می‌کند. بیش از 300 نوع جهش در ژن BRCA2 شناسایی‌شده که اغلب از نوع کلون‌های پايانی می‌باشند (8).

ژن PTEN تولیدکننده تیروزین فسفاتازی است که نقش سرکوبگری تومور برای آن فرض شده است و در کنترل چرخه سلولی نقش دارد. این ژن روی کروموزوم 10q23.31 به طول 105 کیلو جفت باز DNA ژنومی قرار دارد و دارای 9 اگزون می‌باشد. جهش این ژن در سلول‌های رده زایا و نیز جهش‌های سوماتیک در سرطان پستان گزارش‌شده است. یکی از پلی مورفیسم های رایج این ژن 4IVS است که با تشخیص زودرس سرطان پستان همراه است (9).
ژن 2HER توسط 2ERBB کدگذاری می‌شود و برروی کروموزوم 17q21 قرارگرفته و پروتئینی که در انتقال سیگنال نقش دارد را کد می‌کند. مطالعات نشان داده که این ژن نقش کلیدی در تغییر به سمت بدخیمی دارد و سلول‌های دارای این ژن نسبت به رادیوتراپی حساس‌اند. روش اندازه‌گیری این ژن شامل اندازه‌گیری ایمونوهیستوشیمی‌گیرنده 2HER، یافتن مضاعف شدگی ژن‌ها با استفاده از روش‌های FISH یا PCR می‌باشد (10).
ژن 3HER توسط 3ERBB کدگذاری می‌شود و پس از هترودایمرشدن با دیگر اعضای خانواده می‌تواند فسفریله و فعال شود. این ژن برروی کروموزوم 12q13.2 به طول 23651 جفت باز از DNA ژنومی واقع شده است و به پروتئین 1050 اسیدآمینه‌ای گیرنده فاکتور رشد اپیدرمی ، یکی از انکوژن‌های افزایش‌یافته در سرطان پستان ترجمه می‌شود. (11)
ژن -67Ki که نقش مهمی در پاتوژنز سرطان پستان دارد. این پروتئین به‌عنوان یک پروتئین هسته‌ای شناخته می‌شود که با تکثیر سلولی همراه است و می‌تواند در مراحل خاصی از چرخه سلولی ازجمله فازهای M, 2G, 1G وS بیان شود. این ژن بر روی کروموزوم 10q26.2 واقع شده است و دارای 15 اگزون و 14 اینترون می‌باشد.
ژن STAT3 بخشی از خانواده‌ای است که تحت عنوان ژن STAT شناخته می‌شود. این ژن دستورالعمل‌هایی را برای ساخت پروتئین‌هایی که بخشی از مسیرهای سیگنالینگ شیمیایی ضروری در سلول‌ها هستند، ارائه می‌دهد. هنگامی که پروتئین‌های STAT توسط سیگنال‌های شیمیایی خاص روشن و فعال می‌شوند، به درون‌هسته سلول حرکت می‌کنند و به مناطق خاصی از DNA متصل می‌شوند. این پروتئین‌ها به نواحی تنظیم‌کننده نزدیک ژن متصل می‌شوند و روشن و خاموش شدن این ژن‌ها را کنترل می‌کنند. پروتئین‌های STAT بر اساس این عملکرد، فاکتورهای رونویسی نامیده می‌شوند. داده‌ها نشان می‌دهند که پروتئین STAT3 از طریق تنظیم فعالیت ژن، در بسیاری از عملکردهای سلولی ازجمله رشد و تقسیم سلولی (تکثیر)، حرکت سلول (مهاجرت) و خود تخریبی سلول‌ها (آپوپتوز) نقش دارد. این پروتئین در تمام بافت‌های بدن حضور دارد و نقش مهمی در عملکرد سیستم ایمنی دارد. پروتئین STAT3 در سیستم دفاعی نیز نقش دارد این پروتئین با ارسال سیگنال‌هایی در بلوغ سلول‌های سیستم ایمنی به‌ویژه سلول‌های T و سلول‌های B نقش ایفا می‌کند. علاوه بر این، پروتئین STAT3 در تنظیم التهاب که یکی از راه‌های واکنش سیستم ایمنی به عفونت یا آسیب است، نقش دارد. همچنین این پروتئین در فرایندهای سلولی که واکنش‌های آلرژیک را تحریک می‌کنند، نقش دارد. پروتئین STAT3 در سیستم اسکلتی نیز نقش ایفا می‌کند به این شکل که با ساختن سلول‌های تخصصی باعث ساخته‌شدن بافت استخوانی می‌شود.

روش‌های تشخیص سرطان پستان
از جنبه‌های مهم درمان سرطان پستان، تشخیص زودرس آن می‌باشد. در حال حاضراستفاده از تکنیک‌های تصويربرداری مانند ماموگرافی، سونوگرافی، CT، PET، MRI، SPECT يکی از رويکردهای اصلی برای تشخیص و ارزيابی پاسخ به درمان در بیماران مبتلا به سرطان پستان است. ماموگرافی به‌عنوان تکنیک استاندارد طلایی برای تشخیص بیماران مبتلا به سرطان پستان شناخته‌شده است که با مزايای مختلفی از جمله حساسیت و اختصاصیت بالا، ارزان و قابل‌تحمل بودن برای بیمار همراه است. بااین‌حال، وجود معايبی مانند درد و اضطراب، سیگنال کاذب و خطرات پرتويی استفاده از آن را محدود کرده است. از اين رو، به نظر می‌رسد استفاده از تکنیک‌های جديد با خصوصیات بهتر موردنیاز است (شکل 1-1) (15). سونوگرافی یک تکنیک تصويربرداری مهم است که علاوه بر ماموگرافی، برای مديريت و تشخیص آسیب‌شناسی پستان ضروری است. عدم استفاده از اشعه يونیزه کننده در سونوگرافی و حساسیت بالا، آن را به‌عنوان ابزار تشخیصی قدرتمند برای تومورهای پستان در زنان جوان و زنان باردار و شیرده تبديل کرده است (15).
MRI به‌عنوان ديگر ابزار مهم تشخیصی سرطان پستان می‌باشد. اين روش می‌تواند برای جنبه‌های مختلف درمان سرطان پستان از جمله نظارت بر پاسخ به درمان، نظارت بر بیماران در معرض خطر، ارزيابی متاستاز و بررسی عود تومور مورداستفاده قرار گیرد. داده‌های ارائه‌شده توسط MRI می‌تواند اقدامات مختلفی مانند تخلیه پستان، مرحله‌بندی سرطان پستان، ارزيابی میکروسکوپی، ضايعات پیش بدخیم و تومور باقیمانده در بیماران تحت عمل جراحی را به پزشکان پیشنهاد دهد. اين خصوصیات منجر به معرفی MRI به‌عنوان يک روش تشخیصی مناسب برای بیماران مبتلا به سرطان پستان شده است. تکنیک‌های ذکرشده از جمله ماموگرافی، سونوگرافی و MRI می‌توانند به‌عنوان ابزاری مؤثر برای تشخیص بیماری سرطان پستان و همچنین پايش بیماران مبتلا به این نوع سرطان استفاده شوند. با اين حال، اين تکنیک‌ها با محدودیت‌های مختلفی از جمله حساسیت پايین همراه هستند.