کتاب بیان ‏ژن ‏های ‏SNHGI ‏و ‏MIR-195 ‏در ‏بافت ‏نرمال ‏و ‏توموری

فصـل اول 15
دستگاه گوارش 15
ساختمان کولون و رکتوم 15
آناتومی دیواره روده بزرگ 16
سرطان کولورکتال 17
انواع سرطان کولون 18
نوع موردی 18
نوع ارثی و ژنتیکی 18
نوع خانوادگی 19
پولیپوز آدنوماتوز خانوادگی (FAP) 19
سرطان وراثتی غیر پولیپوز کولورکتال (HNPCC) 19
عوامل ابتلا به سرطان 19
سبب شناسی 20
مرحله بندی سرطان کولورکتال 21
درمان 22
بیومارکر ملکولی بالقوه تشخیص سرطان کولورکتال 23
RNA های غیر کدگذار 23
RNA های غیر کدگذار طویل 24
(miRNA) MicroRNA 27
ژن SNHG1 30
ژن 195-miR 31
شکل گیری ایده 32
فصـل دوم 35
مواد و دستگاه های موردنیاز 35
استخراج RNA از بافت 38
روش استخراج RNA از بافت 38
بررسی کمی و کیفی RNA استخراج شده 40
بررسی کمی RNA استخراج شده 40
بررسی کیفی RNA استخراج شده 41
سنتز cDNA 41
طراحی پرایمر برای Real-time PCR 43
با توجه به حساسیت Real – time PCR 43
پرایمرهای مورد نیاز واکنش Real-time PCR 44
ارزیابی کمی بیان ژن با استفاده از روش Real – time RCR 44
رسم منحنی استاندارد 47
بررسی منحنی ذوب 49
انجام واکنش Real – time PCR 49
آنالیز داده های Real – time PCR 51
آنالیز داده ها و بررسی آماری 52
فصـل سوم 55
نتایج 55
کیفیت و کمیت RNA های استخراج شده 55
نتایج حاصل از اندازه گیری غلظت و خلوص RNAها توسط دستگاه نانودراپ 55
تایید اختصاصيت محصولات واکنش Real – time PCR 56
منحنی استاندارد 57
منحنی استاندارد مربوط به ژن SNHG1 58
منحنی استاندارد مربوط به ژن GAPDH: 59
منحنی استاندارد مربوط به ژن miR-195: 60
منحنی تکثیر استاندارد ژن miR-195 60
منحنی استاندارد مربوط به ژن RNU6 61
منحنی تکثیر استاندارد ژن RNU6 61
بررسی منحنی ذوب 62
نتایج تعیین توالی 65
آنالیز بیان ژن ها 66
بررسی سطح بیان SNHG1 در نمونه های توموری نسبت به نرمال 66
سطح بیان SNHG1 در نمونه های توموری با درجه بدخیمی بالا و پایین 67
بررسی ارتباط سطح بیان SNHG1، با سایز در نمونه های بافت توموری 68
سطح بیان miR-195 در نمونه های توموری نسبت به نرمال 69
فصـل چهارم 73
نتیجه گیری 73
منـابع و مآخـذ 81

سرطان کولورکتال
سرطان کولورکتال اغلب به دلیل رشد غیر عادی سلول ها در روده بزرگ اتفاق می افتد که در انواع پیشرفته می‌تواند به بافتهای دیگر بدن متاستاز کند و در آنها تكثیر یابد. این بیماری بسته به محل تومور به انواع سرطان کلون , سرطان رکتوم بسته به محل تومور نیز تقسیم بندی می‌شود . برخی از شرایط موروثی که بیماری سرطان روده بزرگ را ایجاد می کنند، مواردی همچون پولیپ های آدنوماتوز خانوادگی و سرطان کولون غیرپولیپی ارثی هستند؛ اما این ها شامل کمتر از پنج درصد موارد می شوند. تعداد کمی از موارد به خاطر اختلالات ژنتیكی ارثی اتفاق می افتند. کولونوسكوپی از روش های تشخیص اولیه و نمونه برداری اولیه در ارتباط با این سرطان است.
این بیماری معمولا با نئوپلاسم خوش خیم آدنوم آغاز می گردد که به مرور زمان تبدیل به سلول های سرطانی می‌شود و تغییر یک پولیپ آدنوماتوز کوچک به یک سرطان تهاجمی 5 تا 10 سال طول می کشد.
جهش های از دست رفتن کروموزوم در ژن APC در بیش از 80 درصد تومورها و به دنبال آن رشد سلولی افزایش یافته منجر به ایجاد آدنوم اولیه می‌شود. جهش های فعالسازی ژن RAS در گیرنده TGFβ و بدنبال آن جهش حذف در ژن های DCC، SMAD4، SMAD2 منجر به ایجاد آدنوم ثانویه می‌شود.فرایند چند مرحله ای پیدایش سرطان با رخداد جهش حذف کروموزوم p17 در ناحیه ی دربردارنده ی TP53 در بیش از 75 درصد از کارسینوم ها رخ می دهد.
افزایش میزان اختلال یا از دست رفتن پشت سرهم ژن های سرکوب گر تومور از چندین کروموزوم و فعال شدن پروتوانكوژن ها با یا بدون ایجاد نقص در ترمیم DNA همراه است. در یک تومور چندین رده سلولی دارای طیف متفاوتی از جهش ها و تغییرات اپیژنتیكی می‌تواند وجود داشته باشد خصوصا زمانی که بیماری به مرحله متاستاز رسیده باشد.
مراحل ایجاد سرطان کولون همواره به صورت کلیتر به عنوان الگویی برای تكامل سرطان در نظر گرفته می‌شود. افزایش میزان اختلال علاوه بر پروتوانكوژن RAS با از دست رفتن متوالی ژن های سرکوبگر تومور واقع روی چندین کروموزوم با یا بدون نقصی در ترمیم ناسازگاری همراه است .ترتیب وقایع دربروز این سرطان اغلب مواقع مشابه است؛ به عنوان مثال سرطان های تک گیر با ترمیم ناسازگار ی غیرطبیعی نسبت به سرطانهای فاقد ترمیم غیرطبیعی شیوع کمتری دارند ، اما در صورت ایجاد، این احتمال وجود دارد که از طریق مسیر تا حدودی متفاوت ولی بصورت موازی عمل کنند و به نقطه بدخیمی نهایی برسند (11).
انواع سرطان کولون
نوع موردی
شایعترین نوع ابتلا است. در این نوع، بیماری بدون زمینه ارثی و یا فامیلی و معمولا بعد از سن50 سالگی بروز می كند. بر همین اساس مراکز تحقیقات بیماریهای گوارش و کبد انجام آزمون های
غربالگری را برای افراد بالای 50 سال توصیه می کنند.
نوع ارثی و ژنتیکی
حدود 10-15 درصد موارد این بیماری را تشكیل می دهد. از آنجا که میزان ابتلا در بستگان درجه اول فرد مبتلا زیاد است، خوشبختانه با آموزش افراد خانواده و انجام اقدامات پیشگیرانه، از بروز بیماری در سایر افراد خانواده فرد مبتلا می توان جلوگیری کرد(11-10).
نوع خانوادگی
حدود 25 درصد از مبتلایان در این گروه قرار دارند. این سرطان در بستگان و افراد فامیل درجه اول، دوم و سوم مشاهده می‌شود. براین اساس دیگر اعضاء خانواده به درجات مختلف در معرض خطر ابتلا قرار دارند (12-11).
پولیپوز آدنوماتوز خانوادگی (FAP)
تقریبا 1 درصد از افرادی که به سرطان کولورکتال مبتلا می شوند، براساس الگوی وراثت غالب اتوزومی به این ناهنجاری مبتلا می شوند. در بیش از 90 درصد افراد واجد FAP سرانجام سرطان روده ایجاد میشود. در این بیماری افراد دچار پولیپ های متعدد و بی شماری در سرتاسر روده بزرگ و گاهی سایر قسمتهای دستگاه گوارش می شوند (13-12).
سرطان وراثتی غیر پولیپوز کولورکتال (HNPCC)
این سرطان کولورکتال خانوادگی معمولا در نزدیک راست کولون رخ می دهد و براساس الگوی وراثتی غالب اتوزومی به ارث می رسد. ژن درگیر در این بیماری MMR است که از مشخصه های آن ابتلا در سن جوانی است (14-13).
کولورکتال از سومین سرطان های شایع شناخته شده در زنان و مردان در امریكا است. اگرچه آمار مرگ و میر سرطان کولورکتال در مردان و زنان کاهش یافته است اما همچنان دلایل متعددی برای بروز آن وجود دارد. بررسی سیستماتیک انجام شده نشان می دهد که کولورکتال چهارمین سرطان رایج در مردان و دومین سرطان رایج در زنان در ایران است (16-15).
عوامل ابتلا به سرطان
تاریخچه خانوادگی: اگرچه دلایل آن به وضوح مشخص نیست اما ژن های به ارث رسیده ، فاکتورهای محیطی یا ترکیبی از این دو ممكن است ریسک خطر سرطان کولورکتال را افزایش دهد. تاریخچه فامیلی مشخص کننده‌ی زمان لازم برای شروع کولونوسكوپی است (17).
سندرمهای به ارث رسیده : دو سندرم رایج به ارث رسیده که با سرطان کولورکتال مرتبط است FAP، HNPCC هستند . سندرم های دیگر که ممكن است ریسک گسترش این سرطان را افزایش دهد سندرم لینچ ، سندرم تورکوت ، سندرم پوتزجگر است (18-17).
شیوه زندگی:
رژیم غذایی: رژیم غذایی پرچربی و کم فیبر و مصرف بالای غذای آماده و مصرف کم سبزیجات از عوامل ابتلا به این بیماری هستند.عدم تحرک و مصرف دخانیات و مصرف الكل از موارد موثر مهم در بروز این سرطان هستند.
سن: اگرچه ممكن است این بیماری در هر سنی رخ بدهد اما شانس گسترش این بیماری بعد از سن 45 سالگی به طور چشمگیری افزایش می یابد. میانگین سن بروز این بیماری براساس آمارهای موسسه جهانی سرطان 68 سال است.
پولیپ: پولیپ درواقع رشد توده خوشخیم در جدار روده بزرگ است که در صورت ادامه رشد وتجمع جهش ها در آن احتمال ایجاد توده بدخیم را افزایش می دهد.
چاقی: افزایش وزن احتمال گسترش سرطان کولورکتال را افزایش می دهد (18-17).
سبب شناسی
پولیپ ها زائده های گوشتی هستند که در سطح مخاط روده رشد می کنند و معمولا خوش خیم هستند. تجربه نشان داده که تومورهای سرطانی کولون ، میتوانند از پولیپ و یا زائده گوشتی خوش خیم در ناحیه مخاط منشاء بگیرند و چندین سال به طول می انجامد تا از مرحله خوش خیم به مرحله بدخیم یا سرطانی تبدیل شوند. این روند فرصت مناسبی را به وجود می آورد تا بتوان با تشخیص به موقع و انجام اقدامات پیشگیرانه در برداشتن پولیپ ها از بروز سرطان کولون جلوگیری کرد (19). انواع بدخیمی های دستگاه گوارش به دو دسته نئوپلاسم های دستگاه گوارش فوقانی وتحتانی تقسیم می شوند. نئوپلاسم های گوارشی فوقانی شامل انواع سرطان های مری ومعده بوده و بدخیمی های گوارشی تحتانی شامل انواع پولیپ ها و کارسینوم های روده ای، سندروم های پولیپوز و تومورهای کارسینوئید می باشند. با این وجود، روده بزرگ از شایعترین محل های بروز بدخیمی های دستگاه گوارش تحتانی بوده و بیش از بخش های دیگر میزبان نئوپلاسم های اولیه می باشد (20-19).
مرحله بندی سرطان کولورکتال
پس از تشخیص سرطان کولون و رکتوم، لازم است مرحله ای که بیماری در آن قرار دارد تعیین گردد زیرا درمان هایی که ارائه می‌شود ، بستگی به مرحله پیشرفت و میزان گستردگی بیماری دارد. درجه تومور نشانگر وضعیت سلول های توموری از لحاظ تمایز سلولی است و مرحله میزان پیشرفت تومور در بافت را تعیین می‌کند. برای تعیین مرحله بیماری از سیستم TNM که همان وضعیت تومور (T)، گره های لنفاوی (N)، متاستاز (M)، بهره گرفته می‌شود که مرحله بندی تومور کولورکتال طبق سیستم TNM در جدول (1-1) اشاره شده است.
مرحله صفر :درمرحله صفر سلول های بدخیم به تعداد محدود و فقط در لایه مخاطی جدار روده تشكیل شده است ممكن است به صورت پولیپ کوچک و یا زواید های برجسته و یا خراش سطحی دیده شود. شناخت این مرحله اغلب مشكل است و تنها با کولونوسكوپی و نمونه برداری می توان تشخیص داد. بهترین زمان تشخیص بیماری ، این مرحله است. زیرا با برداشتن آن می توان به ریشه کن کردن سرطان از بدن امیدوارشد. اقداماتی که برای پیشگیری و غربالگری سرطان کولون انجام می دهیم به منظور شناسایی بیماری درهمین مرحله است، بقیه مراحل به تفكیک در جدول 1-1 اشاره شده است (22-21).

درمان
گسترش بیماری موجب به کارگیری چندین روش درمانی می‌شود این در حالی است که شناسایی بیماری در مراحل اولیه منجر به بكارگیری روش های درمانی به نسبت ساده تری می‌شود. به عنوان مثال شناسایی بیماری در مرحله صفر و یک منجر می‌شود که با بكارگیری کولونوسكوپی و یا عمل جراحی درمان کامل صورت گیرد اما در صورت انتشار بیماری به قسمت های مختلف بدن اقدامات درمانی دیگری از جمله شیمی درمانی ورادیوتراپی نیز می توان بهره گرفت (14-13).
بیومارکر ملکولی بالقوه تشخیص سرطان کولورکتال
یكی از موثرترین راه های افزایش شانس بقای بیمار ، بهبود روند درمان و کاهش هزینه های مالی و روانی تشخیص سریع و زودهنگام سرطان است. به همین دلیل همواره یافتن راهی سریع ، مطمئن و کمترتهاجمی ، برای تشخیص به موقع از دغدغه های محققان بوده است. حاصل تلاش های دانشمندان یافتن مارکرهای ملكولی متعددی برای تشخیص سرطان بوده است که هرکدام از مارکرها خصوصیات خاص خود را دارند (23). مارکر ملكولی مناسب ، مارکری است که بتواند ارتباط مستقیم با عود بیماری و یا شانس بقای بیمار داشته باشد و نیزآنالیزهای آماری انجام شده تایید کننده ی صحت آن باشد. انتخاب مارکر باید بر اساس شواهد موجود در تداخل آن در مسیرهای زیستی بوده و با توجه به شرایط بیماری افزایش یا کاهش نشان دهد (24-26).
RNA های غیر کدگذار
RNA های غیرکدکننده (ncRNA) عموما بعنوان مولكول های RNA تنظیمی هستند. در انسان توالی های غیرکدکننده پروتئین حدود 98 % کل ژنوم را تشكیل می دهند. شواهد اخیر نشان می دهد در سلول های جانوری بخش عمده ای از فراورده های RNA تولید شده RNA های غیر کدکننده پروتئینی یا ncRNA هستند که ظاهرا هیچ پروتئینی را کد نمی کنند. پردازش مولكولی ncRNA ها منجر به تولید RNA های فعال کوچک مانند: microRNA، SiRNA، SnoRNA در بسیاری از اوقات می‌شود. این ncRNA ها از طریق میانكنش مولكولی با DNA، RNA و پروتئین در مراحل حیاتی کنترل بیان ژن مانند تغییرساختارکروماتین ، تنظیم رونویسی ، پیرایش pre-mRNA و نیز کنترل فرایند ترجمه نقش مهمی را دارند (30). در این میان ncRNA های طویل تر از 200 نوکلئوتید به عنوان RNA های غیر کدگذار طویل (Long non coding RNA) ها شناخته می شوند. LncRNA ها همانند mRNA ها توسط RNApol ΙΙ همراه با فرایندهای کلاهک گذاری، پردازش و پلی آدنیلاسیون ایجاد می شوند. رونوشت اولیه 45S که طی نسخه برداری ایجاد می‌شود به دنبال تبدیل یوریدین به سودویوریدین وتغییرات دیگر، شكست های آنزیمی rRNA 28S، 18S، 5.8S را تولید می‌کند و با همایش پروتئین های ریبوزومی رفته رفته زیرواحدهای ریبوزومی شكل می گیرند (31). واکنش های شكست وتمام تغییرات به مولكول های RNA هستكی کوچک نیاز دارند که به صورت کمپكس پروتئین SnoRNP در هستک وجود دارد . فرایند پردازش ریبوزوم که شامل متیلاسیون تغییر بازها وشكست است بوسیله ی SnoRNP صورت می گیرد. SnoRNP ها بوسیله ی توالی های خاصی که بسیار حفظ شده اند و به آنها letterate box می گویند، به rRNA اضافه می شوند و این مكمل شدن منجر به تغییرات ذکر شده می گردد. نوع H/A منجر به تبدیل یوریدین به سودویوریدین می‌شود و نوع C/D در متیلاسیون ریبوز شرکت می‌کند (32-30).
RNA های کوچک هستكی (snoRNAs) برای سال های زیادی یكی از شناخته شده ترین انواع ncRNA هاست. RNA های کوچكی هستند که 60 تا 300 نوکلئوتید طول دارند و اغلب در هستک مشاهده می شوند. موقعیت هستكی آنها ارتباط مستقیمی با عملكرد آنها دارد. اغلب SnoRNA ها به عنوان RNA راهنما برای مدیفیكاسیون های بعد از رونوشت برداری RNA ریبوزومی و بعضی از RNA های هستکی همراه با بعضی از فرایندهای پردازش هستكی رونوشت اصلی درگیر هستند. این مدیفیكاسیون های بعد از رونوشت برداری برای تولید ریبوزوم مناسب و کارا ضروری اند (33-35).