159,000 تومان
تعداد صفحات | 114 |
---|---|
شابک | 978-622-378-387-6 |
انتشارات |
عنوان کتاب:
حساسیت گونههای انتروکوکوس فکالیس و فاسیوم جدا شده از طیور
نویسندگان:
دکتر نگین فرهادی - دکتر سعید رادمنش
مطالعه حاضر در دو فصل زمستان سال 97 و بهار سال 98 (در هر فصل 50 نمونه ) مجموعاً 100 نمونه سوآب کلواکی از تعداد 100 طیور گوشتی با سنین مختلف در مرغداریهای استان کردستان و بهصورت خوشهای تصادفی اخذ گردید. سوآبها در داخل میکروتیوپهای استریل حاوی محلول سرم فیزیولوژی استریل گذاشته و فوراً به آزمایشگاه تحقیقاتی دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد سنندج منتقل گردید.
خلاصه و نیز همراه با شرح اقدامات صورت گرفته و به ترتیب توضیح داده شدهاند:
در مرحلهی ابتدایی بهمنظور حفظ استریلیته کار و اطمینان، اقدام به استریلیزاسیون سوابها گردید. بدین ترتیب برای هر نمونه پرنده دو عدد سوآب چوبی سر پنبهای داخل ورق آلومینیوم قرار داده شد سپس در داخل دستگاه اتوکلاو به مدت مشخص تا رسیدن به دمای استریلیزاسیون قرار داده شد.
در مرحلهی بعد میکروتیوبهای 5/1 ml در داخل یک جار شیشهای به مقدار کافی قرار داده شد و از آنجائی که ظروف شیشهای به دلیل دمای بالای داخل اتوکلاو فشار بالای هوا در معرض انفجار قرار دارند، درب ظرف بهطوری که مقدار کمی جریان هوا وجود داشته باشد بسته شد. سپس در داخل دستگاه اتوکلاو به مدت مشخص تا رسیدن به دمای استریلیزاسیون قرار داده شد. پس از اتمام استریلیزاسیون به هر میکروتیوب 5/1-1 سیسی آب مقطر استریل اضافه گردید.
بهمنظور اخذ نمونه بهوسیلهی سوآب از پرندگان برای هر نمونه اقدام به آمادهسازی سوآب استریل گردید. پرندگان در شرایط آرامش و با حفظ اخلاق و رعایت حقوق حیوانات روی میز قرار داده شدند و ابتدا یک سوآب مرطوب به داخل رکتوم پرنده برده شد و بعد از آغشته سازی به مدفوع و دیوارهی رکتوم پرنده بیرون آورده شد.
برای آماده کردن نمونهها جهت کشت باکتریایی در محیطهای کشت انتخابی و بهمنظور حفظ زندهمانی باکتریهای موجود در نمونههای اخذ شده، نمونههای مدفوعی میبایست داخل مایع استریل حل شوند. بدین منظور بعد از اخذ دو سوآپ کلواکی از هر پرنده، در داخل هر میکروتیوب یک سیسی آب مقطر استریل ریخته شد و سوآبها در داخل آب مقطر استریل تکان داده شد تا نمونهها داخل مایع حل شوند و قسمت مورد نیاز سوآپ شکسته و داخل میکروتیوب قرار داده شد.
بعد از اخذ نمونههای توسط سوآپهای استریل و حل کردن محتوای نمونهی اخذ شده به داخل سرم فیزیولوژی داخل میکروتیوبها، نمونهها و یخ به آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشکده دامپزشکی انتقال داده شدند.
در آزمایشگاه نمونهها بر روی محیط بلاد آگار (BA ) حاوی 7-5 درصد خون دفیبرینه گوسفندی کشت و به مدت 48-24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد. کلنیهای با مورفولوژی انتروکوکوس از طریق رنگآمیزی گرم، تست کاتالاز و کشت بر روی محیط بایل اسکولین آگار (BEA ) به روش فنوتیپی شناسایی گردید. به این ترتیب که باکتریهایی دارای همولیز گاما و کاتالاز منفی پس از خالصسازی بر روی محیط BA, به محیط BEA منتقل شدند. به دلیل وجود املاح صفراوی و سدیم آزاید در محیط BEA از رشد سایر باکتریهای گرم مثبت و منفی ممانعت میگردد. انتروکوکها با تجزیه اسکولین به اسکولتین و گلوکز و ترکیب اسکولتین با آهن فریک تولید ترکیب آهن فنولی نموده و رنگ محیط را به قهوهای تیره تا سیاه تبدیل میکنند (جانگ و همکاران، 2007)[1]
برای تشخیص حضور باکتریهای انتروکوکوس در نمونههای کلواکی اخذ شده، در ابتدا اقدام به تهیه محیطهای کشت آگار خوندار و صفرا آسکولین و نمک 5/6 % گردید.
در گذشته انتروکوکوسها را جزو استرپتوکوکوسها تقسیم میکردند ولی آنالیز ژنومی انتروکوکوسها نشان داد که آنها جنس متفاوتی از استرپتوکوکوسها میباشند. در این بخش الگوهای همولیتیک گونههای استرپتوکوکوس بهصورت کلی توضیح داده خواهد شد. بسیاری از استرپتوکوکوسها، گلبولهای قرمز خون را با درجات و الگوهای مختلف لیز میکنند.
بر همین اساس استرپتوکوکوسها را بر اساس همولیز به سه دسته تقسیم میکنند:
آلفا: در این الگو لیز اریتروسیتها اتفاق میافتد و هموگلوبین موجود در این سلولها آزاد میشود، در نتیجه بر روی محیط کشت در اطراف کلنیهای استرپتوکوکوس هاله یا پیگمان سبز رنگ ایجاد میشود.
بتا: در این الگوی همولیتیک، تخریب کامل اریتروسیتها اتفاق میافتد بهطوری که بر روی محیط کشت، اطراف کلنیهای استرپتوکوکوس از حضور اریتروسیتها خالی میشود و تمامی اریتروسیتها لیز میشوند.
گاما: در این حالت هیچگونه همولیزی صورت نمیگیرد. این نوع همولیز مخصوص گونههای انتروکوکوس میباشد.
نکته: آنزیم همولیزین موجود در باکتریهای استرپتوکوکوس سبب تخریب اریتروسیتهای موجود در محیط کشت میشود که خود به دو نوع O و S تقسیم میشود.
برای بررسی الگوی همولیز باکتریهای موجود در نمونههای اخذ شده، انجام تست همولیز بر روی محیط کشت خون آگار ضروری مینمود. بدین منظور ابتدا اقدام به تهیهی محیط کشت خون آگار گردید. ابتدا مقدار ۳۲ گرم از پودر خون آگار (مرک-المان) به ۸۰۰ سیسی آب مقطر ۲ بار تقطیر شده اضافه شد. سپس محلول روی شعله قرار داده شد تا به رنگ شفاف در بیاید. در مرحلهی بعد درون اتوکلاو قرار داده شد تا در زمان مشخص به دمای استریلیزاسیون برسد. بعد از اتمام مرحلهی استریلیزاسیون بهوسیلهی دستگاه اتوکلاو در محیط آزمایشگاه قرار داده شد تا دمای ظرف به ۵۷ درجه سانتیگراد برسد. در مرحلهی آخر مقدار ۶۰ سیسی خون دفیبرینه گوسفندی اضافه شد و درنهایت درون پلیتهای 6 میلیلیتری ریخته شد تا بسته شود و آمادهی کشت و انجام آزمایشات تشخیصی گردد.
بهمنظور انجام کشت، تعداد 100 میکرولیتر از محتویات هر میکروتیوپ بر روی ناحیه یک محیط کشت بلاد آگار قرار داده شده و توسط آنس حلقوی استریل کشت ایزوله چهار مرحلهای انجام شد. سپس پلیتها در داخل انکوباتور در دمای°C 37 به مدت ۴۸ ساعت قرار داده شد (به دلیل این که باکتریهای انتروکوکوسها دیر رشد هستند ۴۸ ساعت داخل انکوباتور قرار داده شد. بعد از گذشت ۴۸ ساعت از کشت، یک پرگنه شبه استرپتوکوکوس که به اشکال مختلفی از جمله پرگنههای سفید رنگ و یا فاقد رنگ و نیز پر گنههای طلاییرنگ بر روی محیط خون آگار دیده میشوند، توسط آنس استریل جدا شده و مجدداً بر روی بلاد آگار خالصسازی شد و درنهایت از کشت خالصشده روی لام قرار داده شد و بهمنظور تائید تشخیص وجود باکتریهای انتروکوکوس اقدام به رنگآمیزی گرم شد.
بعد از جداسازی پرگنههای شبه انتروکوکوس اقدام به رنگآمیزی گرم شد. سپس برای مشاهدهی میکروسکوپیک، عدسی روی بزرگنمایی ۱۰۰ تنظیم شد و کوکسیهای گرم مثبت که مانند دانههای تسبیح کنار هم قرار میگیرند مشاهده شد.
بعد از مشاهدهی باکتریهای کوکسی گرم مثبت با زنجیرههای کوتاه در زیر میکروسکوپ، بهمنظور پیشرفت به سمت تشخیص حضور باکتریهای انتروکوکوس و تفریق باکتریهای انتروکوکوس از استافیلوکوکوس، تست کاتالاز بر روی نمونهها انجام شد برای تشخیص میکروارگانیسمهایی که قادر به تولید آنزیم کاتالاز هستند در روی لام مقداری هیدروژن پراکسید ریخته و باکتری بهوسیلهی یک اپلیکاتور درون آن قرار گرفت ایجاد حبابهای اکسیژن کلید تشخیص وجود آنزیم کاتالاز است. بدین منظور ۲ قطره از پراکسید هیدروژن بر روی لام حاوی باکتری چکانده شد و هیچگونه حباب یا واکنش مثبتی مشاهده نشد که نشان از کاتالاز منفی بودن باکتریهای مورد آزمایش بود.
این محیط دارای بایل (نمک صفراوی) و اسکولین نوعی ترکیب گلیکوزیدی که از پوست درخت شاهبلوط به دست میآید) میباشد پس باکتریهایی که قادر به تحمل نمک هستند در این محیط رشد میکنند. درصورتیکه باکتری قادر به هیدرولیز اسکولین باشد گلوکز و اسكولتين یک مولکول الکلی) آزاد میشود سپس اسکولتین با یون فریک موجود در محیط ایجاد کمپلکس سیاه رنگ میدهد که دلیل تشکیل رنگ سیاه در محیط همین واکنش میباشد. برای تهیهی محیط صفرا اسکولین بهمنظور کشت باکتریایی، مقدار 5/64 گرم پودر صفرا اسکولین آگار (مرك، المان) در یک لیتر آب مقطر حرارت داده حل شد و سپس جوشانده شد تا شفاف شود. سپس ظرف حاوی مایع داخل اتوکلاو به مدت 15 دقیقه و رسیدن به دمای 121 درجه استریلیزاسیون قرار داده شد. بعد از آمادهسازی محیط کشت صفرا اسکولین، برای کشت باکتریایی بر روی این محیط بهصورت زیر اقدام شد:
با آنس استریل یک پرگنه از روی محیط خون آگار برداشته شد و روی محیط صفرا اسکولین بهصورت خطی کشت شد. سپس پلیتها به مدت ۲۴ ساعت در دمای C°۳۷ قرار داده شد. با توجه به مباحث مطرح شده در بحث تشخیص و تفریق آزمایشگاهی گونههای انتروکوکوس و کشت باکتریایی بر روی محیط خون آگار و مشاهده همولیز به بررسی بیشتر وجود باکتریهای انتروکوکوس، اقدام شد.
برای بررسی همولیز باکتریهای مورد مطالعه، با آنس استریل یک پرگنه از باکتریهای کشت داده شده درون محیط خون آگار برداشته شد و به یک پلیت جدید منتقل شد و کشت خطی داده شد و درون انکوباتور قرار داده شد تا باکتریهای جدید رشد کنند.
5/6 درصد محیط BHI که حاوی نمک سدیم کلراید میباشد بهمنظور تفریق باکتریهای انتروکوکی از باکتریهای غیر انتروکوکی (دیگر استرپتوکوکوسهای گروه D لانسفیلد) استفاده میشود. محیط رشد BHI یک محیط بسیار غنی از مواد مغذی میباشد که جهت رشد بسیاری از میکروارگانیسمها میتوان از آن استفاده نمود. این محیط همچنین حاوی آگار میباشد که جهت رشد باکتریهای سریع رشد و دیر رشد مؤثر میباشد. محیط BHI بهوسیلهی جوشاندن قلب یا مغز گاو تولید میشود. برای تهیهی محیط نمک ابتدا مقدار ۴ گرم از پودر BHI(مرک، المان) با ۱۰۰ سیسی آب مقطر استریل مخلوط شد و هم زده شد. سپس به این محلول 5/6 گرم نمک طعم خالص اضافه شد.
سپس در لولههای آزمایش استریل به میزان ۵ سیسی از این محلول اضافه شد سپس با آنس استریل یک پرگنه از روی محیط کشت خون آگاردار برداشته شد و به لوله حاوی ۵ سیسی محیط نمک 5/6 ٪ تلقیح و به مدت ۲۴ ساعت در دمای °C 38 قرار داده شد. کدر شدن محیط نشانه رشد باکتری و مثبت بودن تست میباشد.
برای تهیهی این محیط ابتدا مقدار ۲ گرم از پودر BHI (مرک، المان) با ۵۰ سیسی آب مقطر استریل درون فالکون مخلوط شد و هم زده شد. سپس مقدار ۱۵ سیسی از آن برداشته شد و بهجای آن ۱۵ سیسی گلیسرول اضافه شد و در داخل اتوکلاو قرار داده شد سپس یک سیسی در میکروتیوپهای مخصوص جهت نگهداری در فریزر ۲۰-، ریخته شد سپس از باکتری مورد نظر که بهصورت خالص تهیه شده بود برداشته و درون محیط کشت مایع حاوی گلیسرول و BHI تلقيح شد. در واقع اینطور میتوان گزارش داد که چه تعداد از نمونههای کلواکی اخذ شده از پرندگان حاوی باکتریهای انتروکوکوس میباشند. بعد از نتیجهی به دست آمده از کشت باکتریها بر روی محیط نمک 5/6٪ و تائید حضور باکتریهای انتروکوکوس در نمونهها، بررسی الگوی حساسیت و مقامت آنتیبیوتیکی و انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز صورت گرفت.
تست آنتیبیوگرام به روش آگار دیسک دیفیوژن و بر اساس تفسیر CLSI بر روی جدایهها انجام گرفت.
دیسکهای آنتیبیوتیکی مورد استفاده شامل: ونکومایسین (30mg)، پنیسیلین (10IU)، سفالکسین (30mg)، فلورفنیکل (30mg)، اکسی تتراسایکلین (30mg)، جنتامایسین (10mg)، سفتریاکسون (30mg) و سفازولین (30mg) میباشند.
محیط کشت مولر هینتون آگار مناسبترین محیط جهت انجام تست حساسیت گونههای باکتریایی به آنتیبیوتیکهای مرسوم میباشد چرا که میزان عوامل مهار کننده سولفانامیدها و تری متوپریم و تتراسایکلین در آن کم بوده و همچنین مقدار کاتیونهای کلسیم و منیزیم موجود در آن تنظیم شده میباشد.
در این مطالعه بهمنظور تهیهی محیط کشت مولر هینتون آگار ابتدا مقدار ۴۰ گرم از پودر مولر هینتون آگار (مرک، المان) در داخل ۱ لیتر آب مقطر استریل داخل بشر حل شد و سپس روی حرارت قرار داده شد تا در اثر گرما به حالت شفاف دربیاید. بعد از شفاف شدن محلول، بشر در داخل اتوکلاو قرار داده شد تا با رسیدن به دمای استریلیزاسیون آمادهی استفاده جهت انجام تست حساسیت آنتیبیوتیکی گردد.
بعد از انجام اتوکلاو محتوای محلول آماده شده به داخل پلیتهای۱۰ سانتیمتری ریخته شد تا بعد از سرد شدن و تعادل دمایی آمادهی استفاده گردند.
برای تلقیح باکتری انتروکوکوس مورد مطالعه جهت رشد و انجام تست حساسیت آنتیبیوتیکی درون محیط مولر هینتون آگار میبایست کدورت محیط مایع باکتری به حد استاندار نیم مک فارلند رسیده باشد، بدین منظور ابتدا اقدام به تهیهی محلول استاندار نیم مک فارلند گردید.
کدورت نیم مک فارلند کدورتی در تست آنتیبیوگرام است که میزان کدر بودن نمونه خود را با آن مقایسه میکنیم. این محیط حاوی 108 × 1.5 باکتری است. نحوه تهیه این محیط در آزمایشگاه به شرح زیر است: سوسپانسیونی با جذب نوری 13-0.08 در طول موج 625 نانومتر تهیه گردید.
[1] Jung
تعداد صفحات | 114 |
---|---|
شابک | 978-622-378-387-6 |
انتشارات |
.فقط مشتریانی که این محصول را خریداری کرده اند و وارد سیستم شده اند میتوانند برای این محصول دیدگاه(نظر) ارسال کنند.
نقد و بررسیها
هنوز بررسیای ثبت نشده است.