کتاب تشخیص آزمایشگاهی و مولکولی باکتری اشریشیاکلی

فصل 1 11
مقدمه 11
معرفی سویه‌های بیماری‌زای اشریشیاکلی 15
پاتوتیپ اشریشیاکلی انتروپاتوژنیک 19
پاتوتیپ اشریشیاکلی تولیدکننده‌ی شیگاتوکسین و انتروهموراژیک 21
پاتوتیپ اشریشیاکلی مجتمع شونده‌‌ی روده ای 22
پاتوتیپ اشریشیاکلی چسبنده‌‌ی منتشر 23
پاتوتیپ اشریشیاکلی مهاجم روده ای 24
گروه بندی فیلوژنتیکی اشریشیاکلی 25
تشخیص آزمایشگاهی باکتری اشریشیاکلی 29
فصل2 35
مطالعات 35
فصل 3 43
روش مطالعه 43
مواد و وسایل مورد استفاده 45
شناسایی فنوتیپی باکتری اشریشیاکلی 47
استریل کردن وسایل 48
ضدعفونی سطوح 49
استخراج DNA کنترل مثبت Sakai 52
استخراج DNA نمونه ها 54
الکتروفورز نمونه‌ها 62
نحوه ساخت بافر TBE 66
فصل 4 71
نتایج 71
فراوانی سویه‌های STEC (شیگاتوکسیژنیک اشریشیاکلی) 72
فراوانی اینتیمین (ژن حدت eaeA) 73
فراوانی ژن ehly 73
فصل 5 77
نتیجه¬گیری 77
منابع و مآخذ 87

تغذیه سالم یکی از ابعاد سبک زندگی سالم و یکی از تعیین‌کننده‌های اجتماعی مهم سلامت می‌‌باشد. گروهی از مواد غذایی که تأثیر مهمی در سلامت انسان و پیشگیری از بیماری‌‌ها دارند، میگو و به‌طورکلی آبزیان می‌‌باشند. میگو یکی از منابع مهم غذایی و اقتصادی در جهان محسوب می‌شود و علاوه بر ارزش اقتصادی، میگو از نظر تغذیه‌ای نیز بسیار حائز اهمیت است و به دلیل محتوای بالای پروتئین، ویتامین‌ها و مواد معدنی، جایگاه ویژه‌ای در رژیم غذایی مردم سراسر جهان دارد. میگو به عنوان یک منبع غذایی با ارزش، دارای محتوای بالایی از پروتئین، اسیدهای چرب امگا-۳، ویتامین‌های B12 و D و مواد معدنی مانند سلنیوم، روی و آهن است، این مواد مغذی برای سلامت عمومی بدن، به ویژه در تقویت سیستم ایمنی، سلامت قلب و عروق و بهبود عملکرد مغز و اعصاب ضروری هستند. همچنین، مصرف میگو به دلیل محتوای پایین کالری و چربی، به عنوان یک گزینه مناسب در رژیم‌های غذایی کاهش وزن و کنترل وزن توصیه می‌شود. تحقیقات نشان داده است که مصرف منظم میگو می‌تواند به کاهش خطر ابتلا به بیماری‌های قلبی، سکته مغزی و برخی از انواع سرطان کمک کند. با این حال، مصرف میگو باید با دقت و به میزان مناسب انجام شود، چرا که برخی از گونه‌های میگو ممکن است حاوی مقادیر بالایی از فلزات سنگین مانند جیوه باشند؛ بنابراین، انتخاب میگوی با کیفیت و رعایت میزان مصرف مناسب، از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است (1–4).
میگو یکی از فاسدشدنی‌ترین محصول غذایی است که کیفیت آن می‌تواند به سرعت در حین جابجایی و نگهداری کاهش یابد که عمر مفید محصول را محدود می‌کند (5). میگو مستعد ابتلا به طیف گسترده‌ای از باکتری‌های بیماری‌زا هستند که اکثر آنها قادر به ایجاد بیماری هستند. همچنین شرایط فروش میگو در بازارهای سنتی معمولاً بر پایه رعایت اصول دقیق و تمیزی نیست، بنابراین کیفیت میگو به سرعت کاهش می‌یابد. کیفیت میگو تازه با میکروبیوتای باکتریایی تعیین می‌شود. در این زمینه، استفاده از باکتری اشریشیاکلی (E. coli) به عنوان یک شاخص بهداشتی برای نمونه‌های میگو برای اولین بار در دهه 1930 گزارش شد (2). اشریشیاکلی یک باکتری بی‌هوازی اختیاری متعلق به خانواده Enterobacteriaceae است که معمولاً در روده انسان و حیوانات یافت می‌شود. این باکتری ساکن طبیعی میکروبیوتای میگو نیست، با این وجود، می‌توان آن را به دلیل حضور در محیط‌های آبی آلوده از میگو جدا کرد. اشریشیاکلی به عنوان یک پاتوژن فرصت طلب تلقی شده و برخی گونه‌های آن بیماری‌زا و عامل ایجاد اسهال می‌باشند.
اشریشیاکلی دارای چندین پاتوتایپ مهم بیماری‌زا از جمله شیگاتوکسیژنیک اشریشیاکلی (STEC)، انتروتوکسیژنیک اشریشیاکلی (ETEC)، انتروپاتوژنیک اشریشیاکلی (EPEC)، انتروهموراژیک اشریشیاکلی (EHEC)، انترواگریگیتیو اشریشیاکلی (EAEC)، اینترواینویسیو اشریشیاکلی (EIEC)و دیفیوزلی ادهرنت اشریشیاکلی (DAEC) می‌باشد که یکی از مهمترین پاتوتایپ‌های مولد اسهال و بیماری‌زای اشریشیاکلی پاتوتایپ شیگاتوکسیژنیک (STEC) می‌باشد.
اشریشیاکلی یک گونه متنوع که توانایی کلونیزه شدن و پایداری در میزبان‌های حیوانی، انسانی و محیط را دارد. اشریشیاکلی بیشترین باکتری میله‌ای شکل گرم منفی شایع در فلور مدفوعی است. برخی از سروتیپ‌های اسریشیاکلی می‌توانند باعث مسمومیت‌های غذایی جدی در انسان شوند.
شیگاتوکسیژنیک (STEC) و انتروپاتوژنیک (EPEC) از انواع پاتوتایپ‌های بیماری‌زای گوارشی باکتری اشریشیاکلی هستند که می‌توانند منجر به عوارض گوارشی در انسان شوند و به عنوان پاتوژن زئونوز (مشترک بین انسان و دام) بررسی شده و حائز اهمیت می‌باشند. اشریشیاکلی انتروپاتوژن با چسبیدن و اثر گذاری بر مخاط پوششی روده‌ها منجر به اسهال می‌گردد. این نوع اشریشیاکلی واجد ژن اینتیمین و پلاسمید EAF می‌باشد؛ اما اشریشیاکلی مولد شیگاتوکسین علاوه بر این که واجد ژن‌های اتصال و اثرگذاری هستندقادر به تولید شیگاتوکسین هستندکه به عنوان یک فاکتور حدت بسیار مهم در اشریشیاکلی مولد اسهال نقش دارند (7). ژن شیگاتوکسین واجد دو زیر واحد 1 وst1 , sx است که ممکن است حاوی یکی، هر دو یا ترکیبی از زیرگروه‌ها باشد، محصول این زیر رده‌های ژنومی قادر به مهار سنتز پروتیین در سلول هستند و در نهایت منجر به مرگ سلول می‌گردد. شیگاتوکسین 2 بسیار سمی تر از شیگاتوکسین 1 است و اغلب با ایجاد سندرم همولیتیک اورمیک مرتبط است (8,9).
شیگا توکسین در بدن، سلول‌های اندوتلیال عروق خونی، مخاط دستگاه گوارش، کلیه‌ها، مغز و بافت‌های دیگر را مورد هدف قرار داده و منجر به نشت مایعات و خونریزی میگردد (10).
سویه E.coli O157: h7 تولید کننده شیگا توکسین یکی از باکتری‌های بیماری‌زای منتقل شونده از طریق مواد غذایی است، مهمترین بیماری‌هایی که بوسیله این سویه ایجاد میشوند شامل: اسهال خفیف، کولیت خونریزی دهنده، پورپورای ترومبوسیتوپنیک، سندرم اورمی همولیتیک و مرگ همراه با بروز ناگهانی در تمام سنین است (9).
وروتوکسیژنیک معمولاً توسط آب آلوده باعث ایجاد اسهال در کودکان و مسافران میشود و همچنین عامل اسهال در حیوانات تازه متولد شده مخصوصا در بچه خوك‌ها و گوساله‌ها و بره‌ها می‌باشد. آلودگی مدفوعی غذا و آب نوشیدنی مسیر اصلی ایجاد عفونت براي انسان میباشد و به نظر در حیوانات آلودگی محیط نقش مهمی را بازي میکند (11).
انتروپاتوژنیک اشریشیاکلی علت عمده اسهال کودکان در کشورهاي توسعه نیافته است. بیشتر کودکان زیر 2 سال توسط این پاتوژن تحت تأثیر قرار گرفته و معمولاً بوسیله غذاي آلوده منتقل میشود. انتروهموراژیک اشریشیاکلی عامل علائم وسیعی در انسان‌ها می‌باشد که از یک اسهال ملایم تا کولیت هموراژیک و سندرم ارومیک هموراژیک کشنده متغیر می‌باشد (11).
گاو سانان بویژه گوساله یکی از مخازن اصلی STEC میباشد و انتقال باکتري از حیوانات به انسان از راه مستقیم تماس با آب، خاك، فضولات نشخوارکنندگان و مصرف مواد غذایی مانند شیر خام و پاستوریزه آلوده، ماست، پنیر، همبرگر، سوسیس، گوشت خورده شده، سبزیجات، آب میوه‌ها (بویژه آب سیب) وجود دارد (12).
انترواینویسیو اشریشیاکلی دارای ژن ipaH است که دلیل ایجاد دیسانتری می‌باشد این ژن توسط 4 گونه شیگلا و همچنین انترواینویسیو اسریشیاکلی تولید می‌شود و به نظر می‌رسد از طریق غذا و آب آلوده انتقال می‌یابد (11).
پاتوتیپ انترواگرگیتیو اشریشیاکلی (EAEC) از مهمترین عوامل باکتریائی در رابطه با بیماري‌هاي اسهالی اندمیک و اپیدمیک در کشورهاي پیشرفته و به خصوص در حال توسعه میباشد. اغلب سویه‌هاي انترواگرگیتیو اشریشیاکلی داراي پلاسمید حدت 60-65 مگا دالتونی است که جزء یک کیلو بازي این پلاسمید داراي ProbeEAEC می‌باشد که به طور وسیع در مطالعات اپیدمیولوژي مورد استفاده قرار میگیرد. پاتوتایپ دیفیوزلی ادهرنت اشریشیاکلی در کودکان 1 تا 5 ساله اسهال غیرخونی ایجاد میکند. برخی گزارشات اشاره به این موضوع دارند که ممکن است این سویه‌ها نقش مهمی در اسهال در کشورهاي پیشرفته داشته باشند (13)
وجود اشریشیاکلی در غذا بیانگر آن است که سایر میکروارگانیسم‌هاي انتروباکتریاسه و به ویژه میکروارگانیسم‌هاي با منشاء مدفوعی یا روده‌اي ممکن است در غذا وجود داشته باشد که بسیاري از آنها بیماري زا هستند، بنابراین نظریه اینکه در امر کنترل کیفی مواد غذایی، بررسی و ارزیابی تک تک کلی‌فرم‌ها و نیز میکروارگانیسم‌ها امکانپذیر نمی‌باشد، بنابراین از اشریشیاکلی به عنوان نماینده یا شاخص کلی‌فرم‌ها در ارزیابی بهداشتی مواد غذایی استفاده می‌گردد.
پاتوتایپ STEC باعث اسهال، کولیت هموراژیک و سندرم همولیتیک-اورمیک (HUS) در انسان در سراسر جهان شده که میتواند در افراد سالم نیز یافت شود (14). اهمیت دسته بندی و طبقه بندی شیگاتوکسین به انواع مختلف زیرگروه‌ها به این دلیل است که برخی از انواع و گونه‌های شیگاتوکسین با شدت بیماری در انسان ارتباط نزدیکتری دارد؛ بویژه که این عفونت ممکن است منجر به عواقب تهدید کننده زندگی مانند سندروم اورمیک همولیتیک (HUS) شود (6). شیگا توکسین در بدن، سلول‌های اندوتلیال عروق خونی، مخاط دستگاه گوارش، کلیه‌ها، مغز و بافت‌های دیگر را مورد هدف قرار داده و منجر به نشت مایعات و خونریزی می‌‌گردد (6).
سويه هاي اشريشياكلي وروتوكسيژنيك (VTEC) توكسيني ترشح مي كنند كه به دليل توانايي آن در كشتن سلول هاي vero، وروتوكسين و به دليل شباهت آن به نوروتوكسين شيگاي مترشحه از شيگلا ديسانتري تيپ I، توكسين شبيه شيگاتوكسين ناميده شده و سويه¬هاي توليدكننده آن نيز به STEC معروف مي باشند که به وسيله ژن stx2 وstx1 كد مي شود (15). يكي ديگر از عوامل بيماري زاي اين سويه، پروتئيني به نام اينتيم (Intimin) است که به وسيله ژن eae كد مي شود. اين پروتئين مسئول اتصال نزديك باكتري به سلولهاي اپيتليال روده و ايجاد آسيب طي مكانيسم هاي خاصي به نام اتصال و محو شدن است (1).
برای بررسی ژنوتیپی پاتوتیپ‌‌ها، باید ژن‌‌های کد‌‌کننده‌‌ی عوامل اصلی حدت در آن‌‌ها شناسایی شود. با مشخص کردن پاتوتیپ از طریق تعیین حضور ژن‌‌های کد‌‌کننده‌‌ی عوامل حدت، می‌‌توان گفت که باکتری می‌‌تواند به صورت بالقوه ایجاد آسیب نماید که البته این توانایی با بیان ژن، بالفعل می‌‌شود، از این رو تعیین پاتوتیپ جدایه‌‌های اشريشياکلي‌ حائز اهمیت می‌‌باشد.

گروه بندی فیلوژنتیکی اشریشیاکلی
اشریشیاکلی یکی از نطبیق پذیرترین گونه‌های باکتریایی است. در دستگاه گوارش به عنوان یک همزیست مهم مطرح است. از طرفی می‌تواند هم در دستگاه گوارش و هم خارج از دستگاه گوارش ایجاد بیماری نمایند. این تنوع زیستی به خاطر سطح بالای انعطاف در ژنوم و نقل و انتقالات افقی ژنتیکی است. تنوع بالای فنوتیپی اشریشیاکلی در واقع به دلیل تعداد زیاد ترکیبات مختلف ژنی است. علی رغم جریان ژنی وسیعی که در باکتری اشریشیاکلی دیده می‌شود، اما ساختار جمعیتی آن همچنان به صورت کلونال می‌باشد به گونه‌ای که می‌توان آن‌ها را در هفت گروه اصلی فیلوژنتیکی A، B1، B2، C، D، E و F و 5 خوشه‌ی 1، 2، 3، 4 و 5 قرار داد. نشان داده شده است که پس زمینه ژنتیکی در کسب، حفظ و بیان DNA خارجی نقش دارد (23).
هنوز ارتباط مشخص بین پس زمینه‌ی فیلوژنتیکی با حدت یا اختصاصیت میزبانی پیدا نشده است. با این وجود شواهدی مبنی بر بیماری‌زا تر بودن برخی گروه‌های فیلوژنتیکی وجود دارد. مطالعات نشان می‌دهد که با مقایسه‌ی سویه‌های مختلف بیماری‌زا و غیر بیماری‌زای اشریشیاکلی به دست آمده از حیوانات و انسان، احتمالا عفونت‌های ادراری بیشتر توسط گروه‌های فیلوژنتیک B2 بوجود می‌آید. در حالی که عفونت‌های داخل روده‌ای بیشتر توسط گروه‌های فیلوژنتیک A، B1 وE بوجود می‌آید. با این حال، مجموعه‌ای از ادهزین‌های خاص در گروه‌های فیلوژنتیکی غیر B2 حیوانی در تمام پاتوتیپ‌ها شناسایی شده است. مطالعات متعددی بر اساس سروتایپینگ، الکتروفورز آنزیمی چندجایگاهی ، پروفایل‌های پروتئین غشای خارجی، PFGE ، ریبوتایپینگ، RAPD ، وابستگی گروهی فیلوژنتیکی و محتوای ژن حدت، ارتباطات نزدیکی بین جدایه‌های انسانی و حیوانی را نشان می‌دهد (24).
نکته جمع بندی بسیارمهم و به زبان ساده:
در واقع اشریشیاکلی پاتوتایپ شیگاتوکسیژنیک (STEC): یعنی حضور ژن‌های حدت stx (stx1, stx2) بدون حضور ژن حدت eae.
و پاتوتایپ انتروپاتوژنیک (EPEC): به هیچ عنوان شیگاتوکسین تولید نمی‌کنند و در واقع دربردارنده ژن حدت eae به تنهایی بدون حضور stx (حال یا با حضور ژن حدت ehly و یا بدون حضور ژن ehly) می‌باشد.
و پاتوتایپ انتروهموراژیک(EHEC): اشریشیاکلی تولید کننده‌‌ی شیگاتوکسین (STEC) عامل اسهال خونی و سندروم اورمیک همولیتیک می‌باشد؛ و در واقع دربردارنده ژن حدت stx + eae می‌باشد. مهم ترین سروتیپی که در پاتوتیپ EHEC یافت می‌شود، سروتیپ 7H: 157O می‌باشد.
هدف از این مطالعه ردیابی ژن‌های کدکننده شیگاتوکسین و اینتیمین در جدایه‌های اشریشیاکلی جدا شده از میگو، به کمک آزمون PCR می‌باشد. باتوجه به این که این بیماری ارتباط مستقیمی با مصرف گوشت و فراورده‌های غذایی آلوده و بدنبال آن نشان دادن علایم بیماری دارد و از آنجایی که نیاز به مصرف گوشت و محصولات غذایی و همین طور محصولات غذایی دریایی یکی از نیاز‌های اجتناب ناپذیر انسان در روزمره می‌باشد این مطالعه و دسترسی به اهداف فوق حائز اهمیت می‌باشد.
جدایه‌های اشریشیاکلی از مدفوع اغلب حیوانات تامین کننده غذای انسان جداسازی می‌‌شود، بنابراین محصولات و فراورده‌های غذایی آلوده آنها بعنوان یک خطر تهدید کننده سلامت عمومی جامعه است و شناخت و تعیین پاتوتایپ‌های اشریشیاکلی در بررسی اپیدمیولوژی و کنترل بیماری موثر و ارزشمند می‌باشد.